Vita cellulare, morte e tutto il resto

La scoperta che a volte le cellule morte apparentemente riescono a risorgere da sole ha portato i ricercatori a esplorare fino a che punto possono spingere il punto di non ritorno.

La morte non è sempre irreversibile. Le cellule che sembrano morte o muoiono a volte possono rianimarsi attraverso un processo chiamato anastasi.

 

"Quando le cellule non sono più necessarie, muoiono con quella che può essere definita solo grande dignità", ha scritto Bill Bryson in Una breve storia di quasi tutto. La saggezza ricevuta è stata a lungo che questa marcia verso l'oblio, una volta sufficientemente avanzata, non può essere invertita. Ma mentre la scienza traccia i contorni della funzione cellulare in modo sempre più dettagliato, una concezione più fluida della vita e della morte cellulare ha iniziato a prendere il sopravvento.

Forse la prova più drammatica di ciò è emersa lo scorso aprile, quando un team della Yale School of Medicine ha attirato l'attenzione globale per ripristinare brevemente l'attività cellulare nei cervelli morti. I neuroscienziati Nenad Sestan, Zvonimir Vrselja e i loro colleghi hanno sviluppato un sistema chiamato BrainEx che può perfezionare un cervello con una soluzione a base di emoglobina per nutrire le cellule promuovendo il loro recupero dalla deprivazione di ossigeno, una condizione che di solito è letale per i neuroni dopo circa 10 minuti . Lo hanno testato su cervelli estratti da maiali macellati, privati ​​del sangue e mantenuti a temperatura ambiente per un massimo di quattro ore, rendendoli completamente completamente morti secondo qualsiasi standard convenzionale.

Ora sappiamo che le cellule possono flirtare pericolosamente con il confine della morte - e forse addirittura attraversarlo del tutto - eppure riguadagnare la loro funzione perduta.

Eppure, dopo essere stato perfuso con la soluzione sperimentale per sei ore, molte di quelle cellule cerebrali in via di deterioramento e apparentemente senza vita hanno riacquistato - almeno temporaneamente - parte della loro normale struttura e attività metabolica. Fette di tessuto neurale erano persino in grado di condurre segnali elettrici (per motivi etici, i ricercatori avevano generalmente soppresso quella capacità nel cervello intero degli animali). BrainEx o qualcosa del genere un giorno potrebbe essere usato per ripristinare i cervelli minacciati da ictus, privazione di ossigeno o altre condizioni, anche se prima che ciò sia possibile saranno necessari anni di ulteriori test.

I risultati del team Yale hanno caratterizzato una serie di lavori recenti che sondano lo spazio liminale tra vita cellulare e morte. Sebbene la vita e la morte siano comunemente trattate come alternative, non è così semplice. Medici, etici medici e legislatori hanno faticato a definire il momento della morte per l'uomo: è quando il respiro cessa? Quando il cuore smette di battere? Quando l'attività cerebrale non è rilevabile? Risposte diverse sorgono perché la morte è un processo, e non necessariamente irreversibile.

La barriera tra vita e morte è porosa anche a livello di cellule, le unità fondamentali della vita. I ricercatori stanno imparando che le cellule, una volta ritenute terminali o morte, possono resuscitare se stesse o essere parzialmente resuscitate, nelle giuste condizioni. Studiando i processi che consentono alle cellule del limbo di tornare alla vita, gli scienziati sperano in definitiva di ripristinare le cellule malate in salute, limitare la divisione cellulare iperattiva, rianimare gli organi espirati e persino spianare la strada per le creature estinte a vagare di nuovo.

Dieci ore dopo la morte, le cellule si sono in gran parte disintegrate in una microfotografia di tessuto cerebrale non trattato (sopra) ma sono state recuperate in tessuti trattati con il sistema BrainEx (sotto). In queste immagini di immunofluorescenza, i neuroni appaiono verdi, gli astrociti sono rossi e i nuclei cellulari sono blu.

Stefano G. Daniele e Zvonimir Vrselja; Sestan Laboratory; Yale School of Medicine

Back From the Brink

Intuitivamente, tendiamo a pensare alla resurrezione come a un evento spettacolare e appariscente: una fenice che sorge dalle ceneri. Ma a livello cellulare, la resurrezione è meno una trasformazione trionfante del crescendo di un'orchestra finemente accordata.

Mentre è facile equiparare la morte al caos, la morte cellulare è ben lungi dall'essere un processo casuale: le cellule che stanno per scadere tendono a spegnersi in modo prevedibile. I loro generatori interni rallentano, i loro organelli possono frammentarsi e il loro DNA si rompe.

Per montare un'offerta di resurrezione, le cellule devono invertire questi processi e tentare di riparare il danno attraverso un'operazione complessa e strettamente coreografica. Spesso possono avviare da soli questa intricata guarigione da soli - una scoperta emersa diversi anni fa quando gli scienziati hanno messo in dubbio vecchie ipotesi sulla finalità della morte cellulare.

In questa foto del 2012, i ricercatori Ho Man Tang (a sinistra), Denise Montell (al centro) e Ho Lam Tang (a destra) siedono in un laboratorio presso la Johns Hopkins School of Medicine. Ho Lam Tang è ora professore associato di neurochirurgia presso Johns Hopkins; Ho Man Tang è attualmente presso l'Università cinese di Hong Kong.
Johns Hopkins Medicine

Tra gli interrogatori iniziali più persistenti c'erano i fratelli Ho Lam (Hogan) Tang e Ho Man (Holly) Tang, biologi che all'epoca erano all'università cinese di Hong Kong. I Tang hanno da tempo sentito che una volta che le cellule entrano nell'apoptosi, una classica sequenza di morte che attraversano molte cellule, non possono essere riportate in vita a causa delle caspasi, i cosiddetti enzimi boia che tagliano le proteine cellulari in frammenti. Le caspasi erano considerate l'ultima campana della morte per quasi tutte le cellule: una volta che apparivano, apparentemente non c'era modo di invertire l'apoptosi. Ma Hogan e Holly Tang non erano così sicuri. Abbiamo chiesto, "È davvero vero?", Ha detto Hogan Tang.

Per scoprirlo, nel 2008 i Tang hanno progettato un semplice esperimento. Hanno immerso le cellule tumorali umane nell'etanolo per dare il via all'apoptosi. Ma invece di buttare fuori le cellule presumibilmente morte in seguito, hanno lavato le cellule e le hanno messe in un nuovo terreno di coltura.

I risultati sono stati scioccanti. La mattina dopo, alcune cellule avevano riacquistato il loro aspetto normale e sano. "Non è qualcosa che ci aspettavamo", ha detto Hogan Tang, che ora è alla Johns Hopkins School of Medicine. Al posto delle cellule rimpicciolite e avvizzite che avevano lasciato, trovarono celle a filo con membrane intatte. Organelli chiave come i mitocondri funzionavano di nuovo normalmente. Tutti i segni hanno indicato una drammatica inversione durante la notte - un grande ritorno cellulare.

Le immagini catturano la morte e il recupero indotti da una cellula epatica di topo attraverso l'anastasi. Prima del trattamento, la cellula sembra sana. Dopo 2,5 ore in mezzo contenente etanolo, ha perso gran parte della sua struttura. Lavare e incubare la cellula in un mezzo fresco per un'ora, quindi riportarla ad un aspetto più normale.

Quando i due scienziati hanno identificato gli enzimi attivi durante questo processo, hanno confermato che le cellule potevano riprendersi anche dopo che le caspasi avevano iniziato a tagliare le loro interiora. Nel 2012, Hogan e Holly Tang hanno soprannominato questo processo di recupero cellulare "anastasi", dalla parola greca per "risorgere" o resurrezione.

La biologa cellulare Denise Montell - che ha lavorato con i Tangs presso Johns Hopkins ed è stata co-autrice del documento del 2012 - aveva anche iniziato a mettere in discussione l'esistenza di un punto cellulare di non ritorno. Per indagare, Montell, ora dell'Università della California, a Santa Barbara, ha immerso alcune cellule tumorali umane nell'alcool per iniziare la morte cellulare. L'alcool ebbe l'effetto atteso nel giro di poche ore: le cellule iniziarono a ridursi, le loro membrane si gonfiavano come palloncini d'acqua con punti deboli.

Dopo che il team di Montell ha lavato le cellule per rimuovere l'alcool, hanno rintracciato l'anastasi delle cellule di ora in ora. Inizialmente, pensava che le cellule si fossero completamente ripristinate dopo solo due ore, ma dopo 12 ore si rese conto che le cellule avevano un aspetto molto diverso rispetto a 10 ore prima. I geni di sequenziamento attivi in ​​vari momenti hanno rivelato che "sostanzialmente, ci sono due fasi per il recupero", ha detto Montell. "C'è una fase successiva che prevede processi diversi".

"Le cellule sono in procinto di recuperare anche mentre stanno morendo", secondo Denise Montell, professore di biologia molecolare, cellulare e dello sviluppo presso l'Università della California, Santa Barbara.Per gentile concessione di Denise Montell

Nella prima fase dell'anastasi, le cellule la cui crescita è stata interrotta durante l'apoptosi iniziano a ricrescere e riprendono un normale ciclo cellulare. Nella fase successiva, dopo circa mezza giornata, le cellule iniziano ad allungarsi e si spostano più di prima mentre si dividono e si riproducono - una risposta che, negli animali vivi, potrebbe aiutare i tessuti danneggiati a riempirsi e ricrescere. Montell ha anche notato che i geni che promuovono la crescita e il recupero erano in qualche modo attivi durante l'apoptosi, suggerendo che i semi della potenziale anastasi vengono seminati anche all'inizio dell'apoptosi. "Le cellule sono in procinto di riprendersi anche mentre stanno morendo", ha detto.

Nel 2015, attraverso i lavori iniziati nel laboratorio di Montell e poi proseguiti in quello di J. Marie Hardwick presso Johns Hopkins, i Tang hanno svelato un modo per tracciare l'anastasi negli organismi viventi etichettando i geni degli animali con una proteina fluorescente che brilla solo dopo l'enzima caspase è attivato. Ciò consente loro di vedere quali cellule progrediscono parzialmente attraverso l'apoptosi, quindi invertire la marcia e tornare alla normale funzione. I ricercatori hanno utilizzato varie tecniche per dimostrare che l'anastasi si verifica negli organismi che vanno dai moscerini della frutta ai roditori. Questo è "abbastanza scioccante", ha detto Montell. "Questi eventi non sono rari nemmeno durante il normale sviluppo."

Ciò suggerisce che l'anastasi può persistere a causa del vantaggio evolutivo che offre. "A volte le cellule sono esposte a uno stress grave ma temporaneo e potrebbe non essere vantaggioso per ogni cellula del corpo suicidarsi", ha detto Montell. "Si è evoluto come un modo per limitare il danno permanente ai tessuti."

Se alcune cellule muoiono a causa della carenza di nutrienti, ad esempio, saranno disponibili più nutrienti per il consumo delle cellule sopravvissute, a condizione che possano invertire la sequenza della morte. Quando Hogan e Holly Tang hanno dato alle mosche della frutta una festa ricca di proteine dopo giorni di privazione, le cellule delle uova volanti che avevano iniziato l'apoptosi hanno invertito il corso e si sono riparate. L'anastasi, quindi, è un contrappeso ai corpi di potatura cellulare che svolgono in condizioni di stress, uno yang energico allo yin dell'apoptosi.

Un risveglio accorto

Mentre l'anastasi è una scoperta relativamente recente, una forma più sottile di resurrezione ha incuriosito i biologi per decenni: il processo utilizzato dalle cellule per trascinarsi fuori dalla profonda dormienza. In una vasta gamma di specie, alcune cellule possono rallentare drasticamente la loro attività, come luci che si attenuano senza oscurarsi completamente. Mentre si soffermano in questo stato di riposo, aspettano che il momento giusto torni in vita - ogni volta che le condizioni sono ideali per prosperare.

Uno degli esemplari di dormienza meglio studiati è la rana di legno, Rana sylvatica, che si congela quando la temperatura scende in inverno. Prima del primo congelamento, la rana trova un nido di lettiera in cui isolarsi. Mentre i cristalli di ghiaccio si diffondono in tutto il corpo, il suo fegato produce glicogeno, un antigelo naturale che impedisce alle cellule di esplodere. Tale adattamento rafforza le cellule contro i danni da congelamento in modo che la maggior parte di esse possa riprendere l'attività normale in seguito.

In una vasta gamma di specie, alcune cellule possono rallentare drasticamente la loro attività, come luci che si attenuano senza oscurarsi completamente.

Quando le rane entrano nella loro prolungata stasi, come ha scoperto Storey nel 2016, le loro cellule secernono una sostanza chiamata beta-fattore di crescita trasformante (TGF-beta), che stimola la produzione di proteine ​​che bloccano i processi cellulari. Allo stesso tempo, queste proteine ​​attivano geni specifici che aiutano nella coagulazione del sangue. Ciò aiuta a garantire che eventuali sanguinamenti minori durante il processo di congelamento vengano controllati durante la dormienza, consentendo ai tessuti della rana di riprendersi più rapidamente quando termina il lungo inverno. Le proteine ​​antimicrobiche si accumulano anche nelle cellule di rana congelate, mantenendo le cellule abbastanza sane da innescare un forte ritorno in primavera.

Mentre pochi animali usano gli stessi metodi di sopravvivenza al freddo delle rane di legno, le cellule di mammifero adottano strategie autoprotettive simili quando dormono. La biologa cellulare Laila Ritsma studia le cellule dormienti nei topi vivi presso il Leiden University Medical Center nei Paesi Bassi utilizzando una tecnica di imaging chiamata microscopia intravitale. Macchia le sue cellule con un colorante fluorescente, che diventa progressivamente più diluito quando le cellule colorate iniziano a moltiplicarsi. "Se una cellula prolifera molto, finirai con pochissima tintura", ha detto Ritsma.

Nelle cellule dormienti, tuttavia, il colorante rimane intensamente concentrato, consentendo a Ritsma di identificare queste cellule a vista. Usando un'etichettatura genetica fluorescente, tiene traccia del destino delle singole cellule dormienti nel tempo. Durante la dormienza, "il metabolismo delle cellule inizia a essere basso - chiudono tutti i percorsi necessari per proliferare", ha detto Ritsma. "Ma non è vero che non fanno nulla".

Nei tumori, alcune frazioni delle cellule maligne sembrano ritirarsi sistematicamente in dormienza, una condizione che le rende resistenti all'assalto mediante chemioterapia o radiazioni.

Le indagini di Ritsma suggeriscono che, come le cellule di rana dormienti, le cellule di mammifero dormienti ottimizzano abilmente le loro possibilità di successo nel risveglio, rannicchiandosi e poi ruggendo indietro quando le condizioni sono migliori. Ha riferito quest'anno che, sulla base di studi di espressione proteica, le cellule di mammifero usano la proteina TGF-beta per controllare il loro stato di dormienza proprio come fanno le cellule di rana di legno. "TGF-beta è molto interessante, perché può indurre dormienza ma può anche indurre proliferazione", ha affermato Ritsma. "Dipende tutto". Ad esempio, TGF-beta stimola l'attività dei geni che rallentano il ciclo cellulare fino a gattonare in modo che una cellula possa rimanere inattiva. Per tornare in vita, una cellula può mettere a tacere questi geni che promuovono la dormienza alterando di nuovo TGF-beta.

Ma questa inversione trionfante può avere un lato oscuro. Come ha descritto Ritsma, nei tumori, una parte delle cellule maligne sembra ritirarsi sistematicamente in dormienza, una condizione che le rende resistenti all'assalto mediante chemioterapia o radiazioni. Può darsi che alcune di quelle cellule dormienti si risveglino in seguito e ritornino al loro frenetico stato di divisione, contribuendo alle recidive di tumori che erano stati in remissione.

Rinascita in forma e inizia

Indipendentemente dal contesto o dalla specie, la resurrezione cellulare è un processo continuo di adattamento e adattamento. Le cellule che si riprendono da diversi tipi di stasi potrebbero sembrare robuste come prima, ma il loro recupero potrebbe essere tutt'altro che uniforme. In un esperimento, Hogan e Holly Tang hanno notato che alcune delle cellule che erano tornate dall'orlo della morte avevano dei difetti nei loro cromosomi dopo l'anastasi. Ciò potrebbe accadere, ha detto Hogan Tang, perché le cellule subiscono danni al DNA durante l'apoptosi e non sono in grado di ripararlo.

Promuovere l'anastasi nei neuroni morenti e nelle cellule cardiache potrebbe aiutare a curare lesioni cerebrali e infarto.
Ho Lam (Hogan) Tang, Johns Hopkins School of Medicine

La maggior parte delle cellule attraversa una fase altrettanto vulnerabile mentre completano il viaggio di ritorno dalla dormienza. Poiché l'acqua si espande man mano che si congela, alcune delle cellule delle rane di legno subiscono le membrane di scoppio e le mutazioni del DNA nonostante il loro arsenale di salvaguardie. Alcune cellule dormienti finiscono per essere troppo danneggiate per essere riparate e devono essere abbandonate, vittime della propria ferita nel limbo cellulare.

Studiando le minuzie di come le cellule si rianimano e di come resistono alle anomalie lungo il percorso, ricercatori come Montell, Tangs e Ritsma sperano di indurre simili tipi di resurrezione nelle cellule umane. "Promuovere l'anastasi nella morte dei neuroni e delle cellule cardiache potrebbe aiutare a curare lesioni cerebrali e infarto", ha detto Hogan Tang. Il piano sta prendendo spunto dal recupero delle cellule di rana di legno mentre studia i modi per scongelare gli organi umani congelati per il trapianto senza danni. Ciò consentirebbe agli organi di essere conservati indefinitamente e spediti ai destinatari di tutto il mondo.

L'arresto delle sequenze di risurrezione nelle cellule potrebbe rivelarsi altrettanto fruttuoso dal punto di vista terapeutico. Durante il trattamento del cancro, ad esempio, molte cellule entrano in apoptosi a causa degli effetti tossici della chemioterapia, che è esattamente ciò che dovrebbe accadere. Tuttavia, le tossine potrebbero non avere alcun effetto sulle cellule tumorali che sono già diventate dormienti e persino le cellule che si riparano attraverso l'anastasi possono conservare un danno genetico permanente. Le cellule di entrambe le categorie potrebbero dare origine a nuovi tumori o causare il ripetersi di quelli esistenti. L'obiettivo di Montell è determinare quali segnali molecolari consentono alle cellule tumorali di progredire attraverso l'anastasi nella speranza di sopprimere o promuovere questi segnali quando necessario.

Kei Miyamoto, parte del team della Kindai University in Giappone che ha tentato di rivitalizzare i nuclei mammiferi, è un ingegnere genetico.
Per gentile concessione di Kei Miyamoto

Tuttavia, i biologi non sanno ancora come identificare quali cellule tumorali possono risvegliarsi dalla dormienza e dividere senza controllo - informazioni che potrebbero essere necessarie per contenere le cellule tumorali trascurate prima che rappresentino un vero problema. Anche la sinfonia dei segnali cellulari che guidano l'anastasi e altri tipi di recupero deve essere ulteriormente decodificata. Per rendere possibile l'anastasi terapeutica, "la cosa più importante è che cerchiamo di identificare l'inibitore dell'anastasi e il promotore", ha detto Hogan Tang. Un'altra domanda irrisolta è come le cellule vicine comunicano tra loro per determinare se ogni cellula tornerà in vita, resterà inattiva o procederà attraverso una sequenza di morte cellulare.

La maggior parte degli studi sulla resurrezione cellulare ha coinvolto cellule considerate in procinto di morire o solo recentemente "morte" secondo i soliti criteri; il lavoro del gruppo Yale su cervelli di maiale macellati che erano morti e non conservati da ore era un caso estremo. Ma alcuni ricercatori non hanno paura di andare molto oltre: hanno tentato di far rivivere i componenti cellulari di un animale estinto che è morto più di 20.000 anni fa.

L'anno scorso, un team di biologi dell'Università giapponese di Kindai, sotto la guida di lunga data della biologa Akira Iritani, ha rimosso frammenti di mammut siberiano lanoso da un congelatore da laboratorio, ha schiacciato il tessuto in minuscole provette ed estratto frammenti microscopici che contenevano nuclei - i centri di controllo che hanno animato le cellule di questo mammifero spento durante l'ultima era glaciale. Con una pipetta più piccola di un ago da cucito, i ricercatori hanno iniettato i nuclei nelle cellule uovo del topo usando una tecnica chiamata trasferimento nucleare. Quindi attesero per vedere se le cellule ibride avrebbero mostrato segni di nuova vita. Gli scienziati si sedettero tesi davanti allo schermo digitale del microscopio, in allerta per qualsiasi accenno di movimento.

All'improvviso, in una delle cellule ricostruite, gli antichi cromosomi dei mammut nuotarono alla vista e iniziarono a collegarsi con i mandrini dell'uovo di topo, che formano l'apparato che normalmente separa i cromosomi nelle cellule in divisione. Mentre la squadra osservava, trafitto, i cromosomi migrarono in due gruppi distinti. Quindi un debole bordo arrotondato apparve intorno a ciascun gruppo - curve che suggerivano l'inizio di due nuclei cellulari dove solo uno era stato prima.

I nuclei delle cellule mammut non avanzarono ulteriormente verso la divisione, forse a causa del danno accumulato dal loro DNA. L'ingegnere genetico Kei Miyamoto, uno dei coautori dello studio, sottolinea che l'allineamento dei cromosomi mammiferi era altamente irregolare e che non ci sono prove che le curvature osservate intorno ai cromosomi fossero i bordi dei nuclei incipiente. Tuttavia, Miyamoto ha definito l'attività osservata "un buon segno". I ricercatori non avevano riportato in vita le cellule mammut di 28.000 anni, ma, contro ogni previsione, avevano almeno acceso una scintilla biochimica all'interno dei nuclei cellulari che era stata animata l'ultima volta molto prima dell'inizio della storia umana.

Ora sappiamo che le cellule possono flirtare pericolosamente con il confine della morte - e forse addirittura attraversarlo del tutto - eppure riguadagnare la loro funzione perduta. Questa flessibilità è sia intenzionale che adattiva; a livello cellulare, come nei più ampi cicli di vita, la morte e il risveglio devono rimanere in uno squisito equilibrio per far prosperare l'intero sistema. Comprendere come viene mantenuto tale equilibrio e come le cellule lo adattano, può darci il potere liberatorio ma temibile di inclinarlo verso la vita.

Fonte:  Quanta Magazine