Inversione dell'invecchiamento epigenetico e tendenze immunosenescenti nell'uomo
Gregory M. Fahy1 | Robert T. Brooke1 | James P. Watson2 | Zinaida Buono3 Shreyas S. Vasanawala4 | Holden Maecker5 | Michael D. Leipold5 | David T. S. Lin6 | Michael S. Kobor6 | Steve Horvath7
1 Intervene Immune, Los Angeles, California, Stati Uniti
2 Divisione di Chirurgia Plastica e Ricostruttiva dell'UCLA, David Geffen School of Medicine, Los Angeles, CA, USA
3 Dipartimenti di Microbiologia e Immunologia, Università di Stanford, Stanford, California, USA
4 Stanford Medical Center, Stanford, CA, USA
5 Institute for Immunity, Transplantation and Infezione, Stanford School of Medicine, Human Immune Monitoring Center, Stanford, CA, USA
6 Dipartimento di genetica medica, BC Children's Hospital Research Institute, Center for Molecular Medicine and Therapeutics, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
7 Human Genetics, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, CA, USA
Corrispondenza
Gregory M. Fahy, Intervene Immune, Los Angeles, CA, USA.
Email: fahy@interveneimmune.com
Indirizzo attuale
Zinaida Good, Stanford Cancer Institute, Stanford University, Stanford, CA, USA
Informazioni sul finanziamento
Intervene Immune, Inc
Astratto
Gli "orologi" epigenetici possono ora superare l'età cronologica in termini di precisione per la stima dell'età biologica. Qui, usiamo quattro di questi stimatori dell'età per mostrare che l'invecchiamento epigenetico può essere invertito nell'uomo. Utilizzando un protocollo inteso a rigenerare il timo, abbiamo osservato cambiamenti immunologici protettivi, miglioramenti degli indici di rischio per molte malattie correlate all'età e un'età epigenetica media di circa 1,5 anni in meno rispetto al basale dopo 1 anno di trattamento (variazione di -2,5 anni rispetto nessun trattamento alla fine dello studio). Il tasso di inversione dell'invecchiamento epigenetico rispetto all'età cronologica è aumentato da −1,6 anni / anno da 0–9 mesi a −6,5 anni / anno da 9–12 mesi. Il predittore di GrimAge di morbilità e mortalità umana ha mostrato una riduzione di 2 anni nell'età epigenetica rispetto a quella cronologica che è persistita sei mesi dopo l'interruzione del trattamento. Questo è a nostra conoscenza il primo rapporto di un aumento, basato su uno stimatore dell'età epigenetica, della durata della vita umana prevista mediante un intervento di invecchiamento attualmente accessibile.
PAROLE CHIAVE
proteina c-reattiva, rapporto linfociti-monociti, cellule T naive, PD-1, PSA, rigenerazione timica
1 | INTRODUZIONE
L'invecchiamento della popolazione è un problema sempre più importante nei paesi in via di sviluppo, portando con sé una serie di problemi medici, sociali, economici, politici e psicologici (Rae et al., 2010).
Negli ultimi anni, molti modelli biomedici per migliorare l'invecchiamento sono stati studiati in modelli animali e alcuni di questi sembrano in grado di invertire gli aspetti generali dell'invecchiamento nei mammiferi adulti sulla base di una varietà di misurazioni fisiologiche (Das et al., 2018; Ocampo et al., 2016; Zhang et al., 2017). Tuttavia, ad oggi, l'evidenza che l'invecchiamento sistemico può essere invertito non è stata corroborata da determinazioni dell'età epigenetica, che ora possono fornire un'indicazione semplice ma convincente del biologico al contrario dell'età cronologica (Horvath & Raj, 2018; Jylhava, Pedersen, & Hagg, 2017). Inoltre, è necessario affrontare in modo specifico l'immunosenescenza derivante dall'involuzione timica (Bodey, Bodey, Siegel e Kaiser, 1997). L'involuzione timica porta all'esaurimento delle popolazioni critiche di cellule immunitarie (Arnold, Wolf, Brunner, Herndler-Brandstetter e Grubeck-Loebenstein, 2011), con conseguente crollo del repertorio del recettore delle cellule T (TCR) nell'uomo dopo l'età di ~ 63 (Naylor et al., 2005), ed è collegato ad aumenti legati all'età nell'incidenza del cancro (Falci et al., 2013), malattie infettive (Ventevogel & Sempowski, 2013), condizioni autoimmuni (Goronzy & Weyand, 2003) , infiammazione generalizzata (Goronzy & Weyand, 2003), aterosclerosi (Dai, Zhang, Wang, Wu e Liang, 2018) e mortalità per tutte le cause (Fernando-Martinez et al., 2013; Roberts-Thomson, Whittingham, Youngschaiyud, & Mackay, 1974; Strindhall et al., 2007). Al contrario, nei centenari si osserva una funzione immunitaria mantenuta (Strindhall et al., 2007). Sebbene la funzione timica nell'invecchiamento dipenda anche dalla fornitura di progenitori delle cellule T dal midollo osseo, che diminuisce in relazione alla produzione di HSC mieloidi con l'età (Akunuru & Geiger, 2016), il numero netto di precursori linfoidi non cambia con anche l'età (Montecino-Rodriguez et al., 2019) e la migrazione dei precursori delle cellule T dal midollo osseo sembrano dipendere dalla funzione timica (Haar, Taubenberger, Doane e Kenyon, 1989).
Per questi motivi, abbiamo condotto quello che potrebbe essere il primo studio clinico umano progettato per invertire aspetti dell'invecchiamento umano, lo studio TRIIM (Rigenerazione del timo, Immunorestoration e Insulin Mitigation), nel 2015-2017. Lo scopo dello studio TRIIM era di studiare la possibilità di utilizzare l'ormone della crescita umano ricombinante (rhGH) per prevenire o invertire i segni di immunosenescenza in una popolazione di uomini putativamente sani di età compresa tra 51 e 65 anni, che rappresenta la fascia di età che precede il crollo del repertorio TCR. rhGH è stato utilizzato sulla base di prove precedenti che l'ormone della crescita (GH) ha effetti ricostituenti timotrofici e immunitari negli animali (Kelley et al., 1986) e nei pazienti umani con HIV (Napolitano et al., 2008; Plana et al., 2011). Poiché l'iperinsulinemia indotta da GH (Marcus et al., 1990) è indesiderabile e potrebbe influenzare la rigenerazione timica e la ricostituzione immunologica, abbiamo combinato rhGH con deidroepiandrosterone (DHEA) e metformina nel tentativo di limitare l'effetto "diabetogeno" di GH (Fahy, 2003, 2010; Weiss, Villareal, Fontana, Han e Holloszy, 2011). Il DHEA ha molti effetti, sia negli uomini che nelle donne, che si oppongono agli effetti deleteri dell'invecchiamento normale (Cappola et al., 2009; Forti et al., 2012; Shufelt et al., 2010; Weiss et al., 2011).
La metformina è un potente mimetico di restrizione calorica nei topi che invecchiano (Dhahbi, Mote, Fahy e Spindler, 2005) ed è stato proposto come candidato per rallentare l'invecchiamento nell'uomo (Barzilai, Crandall, Kritchevsky e Espeland, 2016). Né il DHEA (Riley, Fitzmaurice e Regelson, 1990) né la metformina sono noti per avere effetti timotrofici propri.
2 | RISULTATI
2.1 | Sicurezza del trattamento ed effetti collaterali
Una preoccupazione principale in questo studio era se i livelli aumentati di un mitogeno (IGF-1) potessero aggravare i focolai cancerosi o precancerosi nella prostata. Entrambi questi cambiamenti dovrebbero essere rilevabili misurando i livelli di PSA o PSA liberi in percentuale. Tuttavia, il PSA, il PSA libero in percentuale e il rapporto tra PSA e PSA libero in percentuale, un indice complessivo del rischio di cancro alla prostata, sono migliorati significativamente entro il 15 ° giorno di trattamento e sono rimasti favorevolmente modificati alla fine di 12 mesi (Figura 1a-c). Un breve picco di PSA a 6 mesi in due volontari è stato rapidamente invertito e, dopo la consultazione dei volontari, è stato interpretato come riflesso dell'attività sessuale vicino ai tempi dei test del PSA. Non è stato osservato alcun cambiamento nei livelli di testosterone.
Un'altra preoccupazione significativa era se l'aumento dell'attività immunitaria potrebbe esacerbare l'infiammazione legata all'età. Tuttavia, la CRP è diminuita con il trattamento, il declino ha raggiunto la significatività statistica di 9-12 mesi (Figura 1d). La citochina proinfiammatoria, IL ‐ 6, non è cambiata (Figura 1e).
Non sono stati osservati cambiamenti notevoli in albumina sierica, lipidi, emoglobina, ematocrito, conta piastrinica, elettroliti ed enzimi epatici (Figura 1f). I livelli di insulina sono stati generalmente adeguatamente controllati dalla somministrazione concomitante di DHEA e metformina (Figura 1g) (sebbene un aumento anomalo medio di insulina a 12 mesi) e i livelli di glucosio non sono cambiati (Figura 1h). Infine, i tassi di filtrazione glomerulare stimati (eGFR), che sono rilevanti per il potenziale di acidosi lattica con metformina e per l'efficacia del trattamento, hanno mostrato un miglioramento statisticamente significativo dopo 9-12 mesi (con una tendenza al miglioramento anche a 18 mesi) (Figura 1i). Gli effetti collaterali sono stati lievi, tipici della somministrazione di rhGH e non hanno richiesto modifiche del dosaggio, tranne in due casi. Gli effetti collaterali includevano artralgie (2 casi), ansia (1 caso), sindrome del tunnel carpale (1 caso), ritenzione di liquidi (1 caso), ginecomastia lieve (1 caso) e indolenzimento muscolare (1 caso). Un volontario di prova è stato rimosso dallo studio dopo circa un mese a causa della bradicardia auto-segnalata, che ha preceduto la sperimentazione, e tardiva ammissione di una forte storia familiare di cancro.
2.2 | Risposte rigenerative timiche e del midollo osseo
Sono stati osservati miglioramenti qualitativi evidenti nella densità della risonanza magnetica timica e sono illustrati nella Figura 2. Quantitativamente, l'aumento complessivo della frazione priva di grasso timico (TFFF) è stato significativo a livello p = 8,57 × 10 −17 sulla base di analisi lineare a modello misto , implicando un ripristino della massa funzionale timica. I miglioramenti sono stati significativi in 7 su 9 volontari (Figura 3a-c). Due volontari avevano livelli anormalmente bassi di grasso timico (alto TFFF) al basale e i loro TFFF non miglioravano significativamente con il trattamento (variazioni relative di picco di + 9,6% (p> 0,3) e + 12,4% (p> 0,2); Figura 3b). La loro mancanza di risposta non dipendeva dall'età. Invece, il miglioramento della TFFF era dipendente dalla TFFF basale, indipendentemente dall'età basale (Figura 3c).
In confronto, il BMFFF sternale è aumentato in misura molto minore, ma con tale coerenza (Figura 3d) da raggiungere un elevato significato statistico (Figura 3e; p <.001 per il confronto a punto singolo o p = 9.5 × 10−12 per formale analisi lineare a modello misto). Il midollo osseo, simile al timo, mostrava un pattern di BMFFF aumentato con un contenuto di grasso di base aumentato, ma i dettagli del pattern erano diversi (Figura 3f). Questa differenza, più la più robusta sostituzione del grasso timico rispetto al grasso del midollo osseo, è coerente sia con una specifica inversione dell'involuzione timica che con la regressione generalizzata del grasso corporeo dovuta alla somministrazione di GH e con la possibile stimolazione della produzione di progenitore delle cellule T del midollo osseo da parte di GH (French et al., 2002; Hanley, Napolitano, & McCune, 2005).
2.3 | Sottoinsieme di cellule immunitarie e cambiamenti di citochine
L'analisi delle popolazioni di cellule immunitarie definite dal CyTOF ha rivelato che i cambiamenti più robusti sono la riduzione dei monociti totali e CD38 positivi (Figura 4a, b) e il conseguente aumento del rapporto linfociteto-monocita (LMR) (Figura 4c). Anche l'analisi di correlazione lineare a modello misto in tutti i tempi di trattamento (0, 9 e 12 mesi) ha mostrato correlazioni significative tra TFFF e riduzione della percentuale di monociti totali (r = −0,4, p = 0,039), l'elevazione del LMR complessivo (r = 0,45, p = 0,019), la riduzione della percentuale di CD38 + monociti in percentuale (r = −0,59, p = 0,0012) e l'aumento del rapporto tra linfociti e CD38 + monociti (r = 0,51, p = 0,0066). I cambiamenti nelle popolazioni di monociti medi sono persistiti 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento (p = .012 per i monociti CD38 + normalizzati e p = .022 per i monociti totali normalizzati: Tabella S1) e l'aumento dell'LMR è rimasto molto significativo anche a 18 mesi.
Le cellule T CD8 positive alla PD ‐ 1 ‐ sono diminuite significativamente con il trattamento (Figura 4d). Gating su cellule T naïve, siamo stati in grado di rilevare aumenti significativi delle cellule T CD4 naïve e CD8 naïve (Figura 4e – f) e un aumento significativo (p = .017) della percentuale di cellule CD31 + CD45RA + CD4 + (Recenti emigranti timici CD4 o RTE) nel corso del trattamento (correlazione lineare, Figura S1). Non abbiamo rilevato cambiamenti consistenti nelle cellule T senescenti misurate né come cellule CD57 + né come cellule CD28. Tuttavia, abbiamo rilevato un aumento significativo dei livelli sierici di FGF ‐ 21 (Figura S2).
TABELLA 1 Caratteristiche di invecchiamento epigenetico della popolazione in studio
2.4 | Regressione dell'età epigenetica
Sebbene, in media, le età epigenetiche volontarie di prova (EA) fossero inferiori alle loro età cronologiche (As) al basale [(EA ‐ A) 0 <0, Tabella 1], l'età epigenetica è stata tuttavia significativamente ridotta dal trattamento in base ai risultati di tutti e quattro gli orologi epigenetici (Figura 5a-d), con una variazione media di EA ‐ A dopo 12 mesi di circa 2,5 anni (Figura 5e).
L'effetto del trattamento sulla regressione dell'età epigenetica a 12 mesi non dipendeva dall'età all'inizio del trattamento o da (EA ‐ A) 0 (Tabella 1). L'analisi lineare a modello misto (LMMA) ha mostrato livelli di significatività per i singoli orologi che vanno da p = .0009 – .012 nei mesi 0–12 a p = .0016 – .028 per i mesi 0–18 (Figura 5 legenda). I risultati di LMMA dell'orologio di Horvath sono rimasti invariati (p = 0,018) dopo essersi aggiustati per i cambiamenti nella composizione delle cellule del sangue (conta dei linfociti, percentuale di cellule T CD8 senescenti tra le cellule T CD8 e LMR). Sebbene ci sia stata una tendenza generale per EA-A a tornare indietro verso (EA-A) 0 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento, questa tendenza era incompleta, lasciando in media un miglioramento di oltre 1,5 anni al mese di prova 18 (Figura 5e, p <.001). Inoltre, l'orologio GrimAge, che è specificamente in grado di prevedere l'aspettativa di vita umana (Lu et a., 2019), non ha mostrato alcuna regressione di (EA ‐ A) - (EA ‐ A) 0 dopo il trattamento, con un guadagno di circa 2,1 restano ancora 12 anni al mese di prova 18 (Figura 5d; Tabella 1). Inoltre, il confronto tra i tassi di regressione dell'invecchiamento tra 0-9 e 9-12 mesi ha mostrato che, per ogni stimatore dell'età, il tasso di regressione dell'invecchiamento sembrava accelerare sostanzialmente con l'aumentare del tempo di trattamento (Figura 5a-d e Tabella 1), con un pendenza media su tutti e quattro gli orologi da −1,56 ± 0,46 anni / anno nei primi 9 mesi a −6,48 ± 0,34 anni / anno negli ultimi 3 mesi di trattamento (p <0,005, Figura 5f).
3 | DISCUSSIONE
Lo studio TRIIM è stato progettato per studiare la possibilità di rigenerazione del timo e l'inversione delle tendenze immunosenescenti negli uomini sani che invecchiano minimizzando gli effetti collaterali e tutti i possibili rischi. I nostri risultati supportano la fattibilità di questo obiettivo, ma inaspettatamente portano anche alla luce prove solide che la regressione di molteplici aspetti e biomaker dell'invecchiamento è possibile nell'uomo. Queste due osservazioni possono essere correlate.
La rigenerazione e la riattivazione del timo mediante la somministrazione dell'ormone della crescita sono state stabilite nei ratti e nei cani aginici attraverso il ripristino dell'istologia timica giovanile (Goff, Roth, Arp, e al., E., 1987; Kelley et al., 1986) e per inversione di età Deficit immunitari correlati (Kelley et al., 1986). Nell'uomo, l'esistenza del tessuto timico sopravvissuto dopo i 54 anni di età, necessaria per il successo della rigenerazione del timo negli individui più anziani, è stata messa in discussione (Simanovsky, Hiller, Loubashevsky e Rozovsky, 2012). Rapporti disponibili che indicano un aumento della densità timica di CT e miglioramenti immunologici indotti da rhGH nei pazienti con HIV (Napolitano et al., 2008; Plana et al., 2011), i cui timi sono fisiologicamente inusuali (McCune et al., 1998), non parlano se la rigenerazione è stata osservata in soggetti di età superiore ai 50 anni. Il presente studio ora stabilisce prove altamente significative della rigenerazione timica negli uomini in età normale accompagnati da miglioramenti in una varietà di fattori di rischio di malattia e parametri immunologici correlati all'età, nonché significative correlazioni tra TFFF e cambiamenti favorevoli nelle percentuali di monociti e LMR, indipendentemente dall'età fino a 65 anni all'inizio del trattamento. Queste osservazioni sono coerenti con la nota capacità dell'ormone della crescita di stimolare l'ematopoiesi e la proliferazione delle cellule epiteliali timiche (Savino, 2007). La nostra scoperta di un aumento dei livelli di FGF-21 dopo 12 mesi di trattamento suggerisce che la rigenerazione timica del presente trattamento può essere mediata in parte da questa citochina (Youm, Horvath, Mangelsdorf, Kliewer e Dixit, 2016), che riteniamo sia una nuova scoperta.
Non abbiamo trovato studi precedenti che associano la somministrazione di rhGH a un LMR aumentato o a livelli di monociti ridotti, mentre la somministrazione di DHEA può effettivamente aumentare i livelli di monociti (Khorram, Vu e Yen, 1997). I meccanismi coinvolti non sono chiari, ma l'effetto imprevisto del nostro trattamento sull'LMR può essere di notevole significato, per due motivi.
In primo luogo, LMR più elevate sono associate a prognosi migliori per una varietà di principali fonti di mortalità umana, tra cui almeno 8 tipi di cancro (ad esempio, cancro alla prostata; Caglayan et al., 2019), aterosclerosi (Gong et al., 2018), malattie cardiovascolari (Ji et al., 2017) e ictus (Ren, Liu, Wang, & Gao, 2017)] e sono anche associati a infiammazioni meno generalizzate (Gong et al., 2018). La protezione dalle malattie cardiovascolari è stata associata a un LMR superiore a 5 (Gong et al., 2018). Nel nostro studio, le LMR medie volontarie erano inferiori a 5 al basale ma erano ben superiori a 5 alla fine del trattamento e 6 mesi dopo la fine del trattamento.
In secondo luogo, la grande maggioranza dei monociti è CD38 positiva.
Il CD38 è un ectoenzima NADase e un degradatore del precursore NAD +, nicotinamide mononucleotide e un aumento dell'espressione del CD38 con l'età sembra essere la causa primaria dell'esaurimento del tessuto NAD + correlato all'età nei topi e molto probabilmente anche nell'uomo (Camacho-Pereira et al ., 2016). È stato proposto che l'induzione del CD38 con l'invecchiamento sia guidata dall'infiammazione legata all'età e che abbia origine nelle cellule infiammatorie residenti nei tessuti (Camacho-Pereira et al., 2016), che in linea di principio potrebbero includere i monociti. Sebbene molte altre cellule immunitarie esprimano CD38, non abbiamo rilevato nessun'altra popolazione di cellule immunitarie CD38 + che è diminuita in risposta al trattamento di rigenerazione del timo, suggerendo che i monociti potrebbero avere un significato particolare.
La nostra osservazione di un declino della CRP in combinazione con livelli di monociti ridotti suggerisce quindi la possibilità di un aumento dei livelli di NAD + nei tessuti. Il meccanismo con cui è stata ridotta la CRP non è chiaro, ma la riattivazione della selezione negativa nel timo potrebbe in teoria ridurre l'infiammazione autoimmune; potrebbe anche essere coinvolta l'autorizzazione di virus pronflammatori o cellule somatiche senescenti. Data la relazione tra deplezione di tessuto NAD + correlata all'età e insorgenza di fenotipi dell'invecchiamento (Das et al., 2018; Poljsak & Milisav, 2016), un aumento del contenuto di NAD + nei tessuti potrebbe essere collegato alle nostre osservazioni sull'invecchiamento epigenetico inverso, al associazione generale di LMR superiori con una migliore salute e precedenti osservazioni che collegano il trapianto di timo alla regressione di vari processi di invecchiamento non immunologico (Fabris, Mocchegiani, Muzzioli e Provinciali, 1988). Coerentemente con questa possibilità, abbiamo osservato che forti cali in totale e monociti CD38 +, aumenti di LMR e riduzione di GrimAge sono persistiti per 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento.
Il declino indotto dal trattamento nelle cellule T PD ‐ 1 + CD8 è coerente con la possibilità che il trattamento di rigenerazione del timo riprogrammi epigeneticamente le cellule T CD8 “esaurite” (TEX), una popolazione distinta PD ‐ 1 + CD8 recentemente caratterizzata (Khan et al., 2019 ). Queste cellule sono di grande interesse in parte perché il PD-1 è una molecola del checkpoint immunitario che inibisce le risposte proliferative delle cellule T (Henson, Macaulay, Franzese e Akbar, 2012) ed è coinvolto nell'evasione del cancro del controllo immunitario, portando a intensi sforzi sviluppare inibitori del checkpoint immunitario farmacologico mirati alla PD ‐ 1 (Khan et al., 2019). Il blocco del segnale PD-1 migliora la proliferazione di cellule CD-8 umane "senescenti" (Henson, Macaulay, Riddell, Nunn e Akbar, 2015). Anche i topi sviluppano una sottopopolazione di cellule CD8 esauste con l'invecchiamento che sono PD ‐ 1 + e Tim ‐ 3 + (Lee et al., 2016). Pertanto, la riduzione delle cellule T PD ‐ 1 + CD8 con il trattamento di rigenerazione del timo rappresenta probabilmente un miglioramento significativo dello stato immunitario.
Gli aumenti indotti dal trattamento delle cellule T CD4 naïve e CD8 naïve erano relativamente piccole rispetto ai cambiamenti riportati nei pazienti con HIV trattati con rhGH, ma la nostra popolazione di volontari era pre-immunosensibile e non impoverita di cellule T CD4 naïve e CD8 naïve al basale.
Si sono anche verificate risposte positive nonostante le potenziali complicanze causate dall'invecchiamento dei linfonodi (Thompson et al., 2019). Pertanto, i piccoli aumenti osservati in queste cellule e negli RTE delle cellule T CD4 sono coerenti con l'obiettivo finale di prevenire o invertire il normale collasso del repertorio TCR correlato all'età a età appena superiori a quelle della nostra popolazione di studio (Naylor et al. , 2005).
Ci possono essere meccanismi sia immunologici che non immunologici di inversione epigenetica dell'invecchiamento. GH, DHEA e metformina hanno effetti unici che sono in opposizione all'invecchiamento ed è possibile che la combinazione specifica di questi agenti attivi una gamma sufficientemente ampia di percorsi terapeutici per tenere conto dell'inversione precedentemente imprevedibile dell'invecchiamento epigenetico, anche indipendentemente dal marcatori immunologici che abbiamo misurato.
A questo proposito, va sottolineato che GH e IGF ‐ 1 possono anche avere effetti pro-invecchiamento e che quindi la maggior parte dei gerontologi preferisce ridurre piuttosto che aumentare i livelli di questi fattori (Longo et al., 2015). Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti sull'invecchiamento e sulla GH / IGF-1 sono confusi dall'uso di mutazioni che influenzano la programmazione dello sviluppo dell'invecchiamento, che non è necessariamente rilevante per gli adulti non mutanti. Ad esempio, tali mutazioni nei topi alterano la normale innervazione dell'ipotalamo durante lo sviluppo del cervello e prevengono l'infiammazione ipotalamica nell'adulto (Sadagurski et al., 2015) che può programmare l'invecchiamento in tutto il corpo adulto nei non mutanti (Zhang et al., 2017) . Sembra improbabile che l'abbassamento dell'IGF-1 negli adulti normali non mutanti possa fornire gli stessi effetti protettivi. Un secondo problema con gli studi precedenti è un fallimento generale nel disaccoppiare la segnalazione di GH / IGF ‐ 1 da cambiamenti permanenti nella segnalazione dell'insulina. La longevità umana sembra essere collegata in modo più coerente alla sensibilità all'insulina rispetto ai livelli di IGF-1 e gli effetti dell'IGF-1 sulla longevità umana sono confusi dalla proporzionalità inversa alla sensibilità all'insulina (Vitale, Pellegrino, Vollery e Hofland, 2019). Riteniamo pertanto che il nostro approccio all'aumento di GH / IGF-1 per un periodo di tempo limitato nel contesto più naturale di DHEA elevato, pur massimizzando la sensibilità all'insulina sia giustificato, in particolare alla luce del ruolo positivo di GH e IGF-1 nel mantenimento immunitario, il ruolo del mantenimento immunitario nel ritardo dell'invecchiamento (Fabris et al., 1988) e dei nostri risultati attuali.
Qualunque sia il meccanismo dell'inversione dell'età epigenetica, i quattro orologi epigenetici selezionati, nonostante misurino in qualche modo diverse caratteristiche dell'invecchiamento e siano correlati in modo diverso con la composizione del sangue e la lunghezza dei telomeri dei leucociti, hanno tutti mostrato una significativa regressione dell'età epigenetica. C'è stata anche una marcata accelerazione dell'inversione dell'invecchiamento epigenetico dopo 9 mesi di trattamento. Le implicazioni di quest'ultima osservazione restano da esplorare. Inoltre, sebbene l'inversione dell'invecchiamento epigenetico sembrasse regredire parzialmente dopo l'interruzione del trattamento secondo alcuni orologi epigenetici, ciò non era vero per l'orologio GrimAge, che predice meglio l'aspettativa di vita umana e la durata della salute (Lu et al., 2019). Resta da vedere se le misurazioni di follow-up dell'invecchiamento epigenetico usando l'orologio GrimAge mostreranno un persistente guadagno di 2 anni nell'aspettativa di vita prevista o una perdita graduale dell'aspettativa di vita aumentata rispetto al basale. In quest'ultimo caso, sarà interessante determinare se la ripetizione o il prolungamento del trattamento di prova potrebbero ripristinare o aumentare ulteriormente il guadagno previsto per la durata della vita.
Sebbene l'età epigenetica non misuri tutte le caratteristiche dell'invecchiamento e non sia sinonimo di invecchiamento stesso, è la misura più accurata dell'età biologica e del rischio di malattie legate all'età disponibili oggi.
Ciò giustifica l'uso di orologi epigenetici per stimare l'efficacia degli interventi di invecchiamento putativo su un calendario pratico. Il presente studio sostiene fortemente questo approccio, avendo dimostrato la regressione dell'età epigenetica con un alto significato statistico anche in uno studio pilota di un anno che ha coinvolto solo 9 volontari. Tuttavia, sarà necessario verificare i risultati attuali replicandoli in uno studio di follow-up adeguatamente potenziato. Anche se resta ancora molto da fare, le prospettive generali per un significativo miglioramento dell'invecchiamento umano sembrano essere molto promettenti.
4 | PROCEDURE SPERIMENTALI
4.1 | Reclutamento e selezione volontari
Dieci uomini adulti nominalmente sani dai 51 ai 65 anni sono stati reclutati per lo studio con il passaparola a seguito di annunci pubblici sugli obiettivi del processo. C'erano due coorti, la prima composta da sette uomini e la seconda composta da tre uomini. La coorte 1 è stata trattata da ottobre 2015 a ottobre 2016 e la coorte 2 è stata trattata da aprile 2016 ad aprile 2017.
I volontari hanno prima compilato un questionario di screening online e i candidati qualificati hanno quindi fornito un campione di sangue per la conferma obiettiva dell'ammissibilità alla salute. I candidati che hanno superato la seconda schermata hanno partecipato a una riunione per consentire la valutazione fisica, la verifica della capacità di autoiniezione di rhGH, l'imaging di risonanza magnetica basale (MR) del timo, due ulteriori raccolte di sangue (vedere Appendice S2), il consenso informato e istruzioni su come compilare i diari terapeutici forniti intesi a ricordare ai volontari gli schemi di dosaggio e a segnalare eventuali effetti avversi o irregolarità nel dosaggio.
4.2 | Condotta di prova
Il processo TRIIM è stato condotto dopo l'approvazione del protocollo di studio da parte dell'Aspire Institutional Review Board (Santee, California) e sotto gli auspici dell'IND 125851 della Food and Drug Administration. I volontari hanno ricevuto esami di risonanza magnetica presso il Lucas Center for Imaging, raccolte di sangue presso lo Stanford Blood Center e analisi CyTOF da parte del Human Immune Monitoring Center (HIMC) sotto l'approvazione dell'Ufficio di conformità della ricerca dell'Università di Stanford. Lo studio è stato condotto in modo coerente con la Dichiarazione di Helsinki, Protezione dei volontari umani (21 CFR 50), Commissioni di revisione istituzionale (21 CFR 56) e Obblighi degli investigatori clinici (21 CFR 312). In base alle linee guida FDA per gli studi esplorativi pre-fase I (https: // prsin fo.clini caltr ials.gov/ACT_Check list.pdf), non è stato preregistrato su clinictrials.gov.
Durante la prima settimana di sperimentazione, è stato somministrato solo rhGH (0,015 mg / kg) per ottenere una risposta iniziale all'insulina e durante la seconda settimana, rhGH è stato combinato con 50 mg di DHEA per valutare la soppressione dell'insulina dal solo DHEA. Durante la terza settimana, le stesse dosi di rhGH e DHEA sono state combinate con 500 mg di metformina.
A partire dalla quarta settimana, tutte le dosi sono state individualizzate in base alle risposte particolari di ciascun volontario. Successivamente, il sangue è stato raccolto una settimana prima dei mesi di prova 2, 3, 4, 6 e 9 per consentire ulteriori aggiustamenti della dose in quei momenti (per massimizzare l'IGF-1 e ridurre al minimo l'insulina) e sono stati ottenuti campioni di sangue aggiuntivi a 12 mesi per concludere il periodo di monitoraggio del trattamento. La conformità del dosaggio è stata verificata dalla risposta di IGF-1, DHEAS e insulina alla somministrazione di rhGH, DHEA e metformina, rispettivamente; mediante frequenti comunicazioni con volontari di prova; e mediante revisione retrospettiva dei diari dei farmaci restituiti. Ulteriori esami del sangue di follow-up sono stati effettuati a 18 mesi per la coorte 1; la coorte 2 non era disponibile. In casi selezionati, come ritenuto utile, il prelievo di sangue supplementare è stato effettuato altre volte.
Le cellule mononucleate del siero e del sangue periferico (PBMC) sono state crioconservate presso l'SBC, in quest'ultimo caso usando il 10% di dimetilsolfossido e siero bovino fetale (FBS), e conservate lì e poi presso l'HIMC fino alla fine dello studio per consentire il CyTOF simultaneo analisi e ulteriore distribuzione di alcuni campioni ad altri centri.
Quest Diagnostics ha eseguito emocromo completo per consentire la correzione delle perdite cellulari causate da congelamento e scongelamento o altri fattori, ma in generale, la necessità di correzione è stata evitata riportando i sottogruppi di cellule come percentuali delle loro popolazioni di riferimento (ad esempio, cellule CD4 naïve come una percentuale del totale delle cellule CD4) e aprendo per intarsi singoletti vitali. Altre analisi del sangue sono descritte nell'appendice S2.
rhGH (Omnitrope, Sandoz) è stato fornito a volontari di prova ed è stato auto-somministrato 3-4 volte a settimana, a seconda degli effetti collaterali, prima di coricarsi insieme ad altri farmaci di studio. Tutti i volontari hanno anche ricevuto e chiesto di assumere integratori di 3000 UI di vitamina D3 e 50 mg di zinco elementare al giorno.
4.3 | Imaging e analisi RM
Tutte le scansioni di imaging sono state eseguite sullo stesso scanner MRI Premier Premier 3T presso il Lucas Center for Imaging presso la Stanford University.
Metodi standardizzati per determinare quantitativamente il contenuto di grasso timico non sono stati precedentemente descritti, quindi abbiamo impiegato una metodologia computazionale che è stata precedentemente applicata all'analisi del contenuto di grasso del midollo osseo (Hu, Nayak e Goran, 2011). Questi metodi per la quantificazione del grasso hanno dimostrato di essere più accurati della valutazione istopatologica standard mediante biopsia (Fischer et al., 2012) e forniscono la frazione di grasso timico (TFF) come numero dallo 0% al 100%. La TFF è stata determinata in tre regioni timiche centrali replicate in ciascun punto temporale testato ed è stata utilizzata per calcolare la frazione priva di grasso timico (TFFF) come 100% - TFF. Gli stessi metodi sono stati applicati anche per determinare la frazione fatree del midollo osseo sternale (BMFFF). Per maggiori dettagli, consultare l'Appendice S2.
4.4 | immunofenotipizzazione
I PBMC crioconservati sono stati scongelati in mezzi caldi, lavati due volte e risospesi in tampone CyFACS (PBS integrato con 2% BSA, 2 mM EDTA e 0,1% sodio azide). La vitalità è stata determinata dall'esclusione del colorante blu di tripan (dosaggio Vi ‐ CELL XR, Beckman Coulter Life Sciences). Le cellule sono state aggiunte a una micropiastra con fondo a V (1,5 × 106 cellule vitali / pozzetto) e lavate una volta mediante pellettizzazione e risospensione in tampone CyFACS fresco. Le cellule sono state colorate per 60 minuti su ghiaccio con 50 microlitri di un cocktail di anticorpi marcati con isotopi di metalli pesanti diretti contro 35 marcatori di superficie cellulare (per i dettagli e per dettagli su lavaggio delle cellule, colorazione, permeabilizzazione e gating, vedere Appendice S2) .
4.5 | Determinazione dell'età epigenetica
Lo stato della metilazione del DNA genomico è stato determinato in PBMC precedentemente crioconservati presso il Center for Molecular Medicine and Therapeutics presso la University of British Columbia. Il DNA genomico è stato estratto con il DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germania) e la conversione del bisolfito del DNA estratto è stata eseguita utilizzando un kit di metilazione del DNA Zymo EZ (Zymo Research, Irvine, CA). L'analisi della metilazione del DNA (DNAm) è stata eseguita utilizzando l'Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip (Illumina, San Diego, CA), che misura i livelli di DNAm con risoluzione singola-CpG a 866.836 siti CpG nel genoma umano. La metilazione in siti specifici è stata calcolata come β = Max (M, 0) / [Max (M, 0) + Max (U, 0)], dove Max (M, 0) è l'intensità di fluorescenza degli alleli metilati (M) ( segnale A) e Max (U, 0) è la fluorescenza degli alleli non metilati (U) (segnale B). Pertanto, i valori β vanno da 0 (completamente non metilato) a 1 (completamente metilato) (Dunning, Barbosa-Morais, Lynch, Tavare e Ritchie, 2008).
Gli "orologi" epigenetici specifici scelti per l'uso in questo studio sono stati quelli derivati da Horvath (2013; DNAm age), Hannum et al. (2013; DNAm age H), Levine et al. (2018; DNAm PhenoAge) e Lu et al. (2019; DNAm age G o “GrimAge”). Le motivazioni specifiche per queste scelte sono basate su Horvath e Levine (2015), Marioni et al. (2015) e Triche, Weisenberger, van den Berg, Laird e Siegmund, (2013) e sono descritti nell'Appendice S2.
Abbiamo calcolato gli effetti dell'intervento sull'età epigenetica adattando prima tutti i dati temporali su un modello lineare a effetti misti per dati longitudinali (prelievi di sangue multipli dalla stessa persona, aggiustati per l'età iniziale del DNAm) per seguire le tendenze globali dell'invecchiamento epigenetico. In secondo luogo, per isolare cambiamenti individuali e specifici del tempo più dettagliati, abbiamo calcolato il cambiamento nell'età epigenetica rispetto all'età cronologica per ciascun volontario come (EA ‐ A) - (EA ‐ A) 0 come descritto nel testo, dove EA è l'epigenetico l'età all'età cronologica A e (EA ‐ A) 0 è la differenza di base tra EA e A.
4.6 | analisi statistica
Abbiamo usato la regressione lineare ad effetti misti per spiegare correttamente la natura longitudinale delle informazioni (estrazioni multiple dalla stessa persona). Quando la correzione per il tempo non era necessaria, abbiamo usato le normali regressioni lineari o non lineari. Per i confronti tra pretrattamento e specifici endpoint post-trattamento, abbiamo impiegato il test t, il test t per confronti accoppiati o le alternative selezionate da SigmaPlot quando le ipotesi alla base dei test t non erano giustificate. Per consentire confronti normalizzati a baseline zero del mese, sono stati calcolati i risultati replicati per ciascun volontario al momento zero e ogni risultato replicato è stato diviso per la media per produrre una popolazione di partenze dal 100% che potrebbe quindi essere utilizzata per il confronto con punti temporali successivi. I valori di P riportati non sono corretti per confronti multipli poiché nella maggior parte dei casi non sono stati condotti test di ipotesi indipendenti e, nel caso di entrambi i test multipli per età epigenetica e differenze significative nei risultati CyTOF, tutti i risultati dei test significativi sono stati altamente correlati, rendendo la correzione di Bonferroni eccessivamente conservatore.
RINGRAZIAMENTI
Siamo grati per il supporto poliedrico di Garry Nolan e Sean Bendall. Apprezziamo molto l'utile consulenza e il supporto forniti da Yael Rosenberg-Hasson dell'HIMC e la felice collaborazione di molte altre persone presso l'HIMC, il Lucas Center for Imaging, l'SBC e altre istituzioni del campus di Stanford che hanno permesso l'elaborazione volontaria e seminari nel campus.
Ringraziamo anche i revisori di questo documento, che ci hanno aiutato a migliorare il manoscritto in modi importanti. Siamo particolarmente grati per le generose donazioni personali fornite da molte persone e per una sovvenzione supplementare della Life Extension Foundation, che ha permesso di effettuare ulteriori misurazioni. Lo studio è stato supportato da Intervene Immune, Inc.
CONFLITTO D'INTERESSE
GMF, RTB, JPW e SH sono azionisti o hanno opzioni per l'acquisto di azioni di Intervene Immune, Inc. GMF e RTB sono funzionari di Intervene Immune e sono indicati in una relativa domanda di brevetto di Intervene Immune. Tutti gli altri autori non dichiarano interessi in conflitto.
CONTRIBUTI D'AUTORE
GMF ha progettato e diretto lo studio, compilato i dati per tutta la grafica, preparato la grafica e scritto il manoscritto. RTB ha gestito lo studio; ha contribuito al suo design; ottenuto dati digitali per tutte le analisi CyTOF, TFFF e BMFFF; e ha contribuito al manoscritto. JPW ha prestato servizio come medico di studio, fornendo supervisione medica, supporto, consulenza e valutazione di volontari e assistito con eventi di prova. ZG ha progettato e organizzato il pannello anticorpale per l'analisi CyTOF, ha diretto le analisi CyTOF e ha collaborato agli eventi di prova. SSV ha progettato le tecniche di misurazione TFFF e BMFFF. HM e ML hanno fornito una guida per il corretto trattamento e interpretazione dei dati CyTOF e hanno rivisto e approvato la nostra metodologia CyTOF.
DTSL e MSK hanno eseguito tutte le misurazioni epigenetiche e fornito informazioni utili per il manoscritto. SH ha eseguito tutti i calcoli dell'orologio epigenetico, ha eseguito tutte le correlazioni lineari a modello misto e ha contribuito al manoscritto. Tutti gli autori hanno approvato il manoscritto.
ORCID
Gregory M. Fahy https://orcid.org/0000-0003-0445-7385
Robert T. Brooke http://orcid.org/0000-0001-8492-5198
Zinaida Good https://orcid.org/0000-0003-2343-5771
Shreyas S. Vasanawala http://orcid.org/0000-0002-1999-6595
Michael D. Leipold http://orcid.org/0000-0001-5389-0906
David T. S. Lin http://orcid.org/0000-0001-5695-9446
Michael S. Kobor http://orcid.org/0000-0003-4140-1743
Steve Horvath http://orcid.org/0000-0002-4110-3589
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INFORMAZIONI DI SUPPORTO
Ulteriori informazioni di supporto sono disponibili online nella sezione Informazioni di supporto alla fine dell'articolo.
Come citare questo articolo: Fahy GM, Brooke RT, Watson JP, et al. Inversione dell'invecchiamento epigenetico e tendenze immunosenescenti nell'uomo. Cell invecchiamento. 2019; 00: e13028. https://doi.org/10.1111/acel.13028
Traduzione: Megachirottera
La metformina è un potente mimetico di restrizione calorica nei topi che invecchiano (Dhahbi, Mote, Fahy e Spindler, 2005) ed è stato proposto come candidato per rallentare l'invecchiamento nell'uomo (Barzilai, Crandall, Kritchevsky e Espeland, 2016). Né il DHEA (Riley, Fitzmaurice e Regelson, 1990) né la metformina sono noti per avere effetti timotrofici propri.
2 | RISULTATI
2.1 | Sicurezza del trattamento ed effetti collaterali
Una preoccupazione principale in questo studio era se i livelli aumentati di un mitogeno (IGF-1) potessero aggravare i focolai cancerosi o precancerosi nella prostata. Entrambi questi cambiamenti dovrebbero essere rilevabili misurando i livelli di PSA o PSA liberi in percentuale. Tuttavia, il PSA, il PSA libero in percentuale e il rapporto tra PSA e PSA libero in percentuale, un indice complessivo del rischio di cancro alla prostata, sono migliorati significativamente entro il 15 ° giorno di trattamento e sono rimasti favorevolmente modificati alla fine di 12 mesi (Figura 1a-c). Un breve picco di PSA a 6 mesi in due volontari è stato rapidamente invertito e, dopo la consultazione dei volontari, è stato interpretato come riflesso dell'attività sessuale vicino ai tempi dei test del PSA. Non è stato osservato alcun cambiamento nei livelli di testosterone.
Un'altra preoccupazione significativa era se l'aumento dell'attività immunitaria potrebbe esacerbare l'infiammazione legata all'età. Tuttavia, la CRP è diminuita con il trattamento, il declino ha raggiunto la significatività statistica di 9-12 mesi (Figura 1d). La citochina proinfiammatoria, IL ‐ 6, non è cambiata (Figura 1e).
Non sono stati osservati cambiamenti notevoli in albumina sierica, lipidi, emoglobina, ematocrito, conta piastrinica, elettroliti ed enzimi epatici (Figura 1f). I livelli di insulina sono stati generalmente adeguatamente controllati dalla somministrazione concomitante di DHEA e metformina (Figura 1g) (sebbene un aumento anomalo medio di insulina a 12 mesi) e i livelli di glucosio non sono cambiati (Figura 1h). Infine, i tassi di filtrazione glomerulare stimati (eGFR), che sono rilevanti per il potenziale di acidosi lattica con metformina e per l'efficacia del trattamento, hanno mostrato un miglioramento statisticamente significativo dopo 9-12 mesi (con una tendenza al miglioramento anche a 18 mesi) (Figura 1i). Gli effetti collaterali sono stati lievi, tipici della somministrazione di rhGH e non hanno richiesto modifiche del dosaggio, tranne in due casi. Gli effetti collaterali includevano artralgie (2 casi), ansia (1 caso), sindrome del tunnel carpale (1 caso), ritenzione di liquidi (1 caso), ginecomastia lieve (1 caso) e indolenzimento muscolare (1 caso). Un volontario di prova è stato rimosso dallo studio dopo circa un mese a causa della bradicardia auto-segnalata, che ha preceduto la sperimentazione, e tardiva ammissione di una forte storia familiare di cancro.
2.2 | Risposte rigenerative timiche e del midollo osseo
Sono stati osservati miglioramenti qualitativi evidenti nella densità della risonanza magnetica timica e sono illustrati nella Figura 2. Quantitativamente, l'aumento complessivo della frazione priva di grasso timico (TFFF) è stato significativo a livello p = 8,57 × 10 −17 sulla base di analisi lineare a modello misto , implicando un ripristino della massa funzionale timica. I miglioramenti sono stati significativi in 7 su 9 volontari (Figura 3a-c). Due volontari avevano livelli anormalmente bassi di grasso timico (alto TFFF) al basale e i loro TFFF non miglioravano significativamente con il trattamento (variazioni relative di picco di + 9,6% (p> 0,3) e + 12,4% (p> 0,2); Figura 3b). La loro mancanza di risposta non dipendeva dall'età. Invece, il miglioramento della TFFF era dipendente dalla TFFF basale, indipendentemente dall'età basale (Figura 3c).
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| FIGURA 1 Indici di sicurezza del trattamento. In questa e in altre figure, le barre di errore rappresentano SEM; sono stati ottenuti SEM di base per dati normalizzati come descritto nelle Procedure sperimentali. Gli asterischi indicano p <.05 (*), p <.01 (**) e p ≤ .001 (***). (a) Antigene prostatico specifico (PSA). (b) Cambio piega (FC) in percentuale di PSA libero. (c) Piegare la variazione del rapporto tra PSA e PSA libero percentuale ("fattore di rischio"), che aumenta all'aumentare del rischio di cancro alla prostata. (d, e) Indici pro-infiammatori (proteina c-reattiva (CRP)) e IL ‐ 6). (f) Fosfatasi alcalina sierica (AP), aspartato aminotransferasi (AST) e alanina aminotransferasi (ALT). L'aumento dell'AP, sebbene statisticamente significativo, è stato quantitativamente trascurabile ed è rimasto ben all'interno dell'intervallo normale. (g) Mantenimento dei livelli di insulina entro i limiti superiore e inferiore dell'intervallo normale (indicato dalle linee orizzontali). (h) Mancanza di variazione del glucosio sierico, che è rimasta nell'intervallo normale. (i) Miglioramento del GFR stimato a 9 e 12 mesi di trattamento, con una tendenza al miglioramento continuo 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento. |
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| FIGURA 2 Esempio di cambiamento indotto dal trattamento nell'aspetto della risonanza magnetica timica. L'oscuramento corrisponde alla sostituzione del grasso con tessuto nonadiposo. Le linee bianche indicano il confine timico. Volontario 2 a 0 (a) e 9 (b) mesi. |
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| FIGURA 3 Risultati della rigenerazione quantitativa basata sulla RM. I simboli simili indicano gli stessi individui in ciascun pannello. (a) Modifiche individuali assolute nel TFFF. Miglioramenti statisticamente significativi sono evidenti per ogni individuo ad eccezione di due volontari che hanno mostrato un alto TFFF al basale (stelle); significato complessivo mediante analisi lineare a modello misto: p <9 × 10–17 (vedi testo). (b) Cambiamenti relativi nel TFFF per ciascun individuo. L'età di ciascun individuo all'entrata di prova (annotata accanto a ciascuna riga) non è correlata all'entità delle modifiche illustrate. I valori p più alti (p> .01) per le risposte individuali significative sono indicati con asterischi; per chiarezza, non sono designati livelli di significatività più elevati. (c) Dipendenza sigmoidale della variazione di TFFF a 12 mesi dal TFFF basale, mostrando maggiori miglioramenti per la Timi con TFFF basali inferiori (p <.007). (d) Cambiamenti individuali nella frazione priva di grasso del midollo osseo sternale (BMFFF) (età dei volontari annotata adiacente ad ogni linea). (e) Variazioni globali medie del BMFFF. (f) Dipendenza lineare del BMFFF a 12 mesi dal BMFFF basale (p = .012), che mostra le maggiori variazioni relative negli individui con il BMFFF basale più basso. Non è stato possibile valutare i dati BMFFF per un volontario. |
In confronto, il BMFFF sternale è aumentato in misura molto minore, ma con tale coerenza (Figura 3d) da raggiungere un elevato significato statistico (Figura 3e; p <.001 per il confronto a punto singolo o p = 9.5 × 10−12 per formale analisi lineare a modello misto). Il midollo osseo, simile al timo, mostrava un pattern di BMFFF aumentato con un contenuto di grasso di base aumentato, ma i dettagli del pattern erano diversi (Figura 3f). Questa differenza, più la più robusta sostituzione del grasso timico rispetto al grasso del midollo osseo, è coerente sia con una specifica inversione dell'involuzione timica che con la regressione generalizzata del grasso corporeo dovuta alla somministrazione di GH e con la possibile stimolazione della produzione di progenitore delle cellule T del midollo osseo da parte di GH (French et al., 2002; Hanley, Napolitano, & McCune, 2005).
2.3 | Sottoinsieme di cellule immunitarie e cambiamenti di citochine
L'analisi delle popolazioni di cellule immunitarie definite dal CyTOF ha rivelato che i cambiamenti più robusti sono la riduzione dei monociti totali e CD38 positivi (Figura 4a, b) e il conseguente aumento del rapporto linfociteto-monocita (LMR) (Figura 4c). Anche l'analisi di correlazione lineare a modello misto in tutti i tempi di trattamento (0, 9 e 12 mesi) ha mostrato correlazioni significative tra TFFF e riduzione della percentuale di monociti totali (r = −0,4, p = 0,039), l'elevazione del LMR complessivo (r = 0,45, p = 0,019), la riduzione della percentuale di CD38 + monociti in percentuale (r = −0,59, p = 0,0012) e l'aumento del rapporto tra linfociti e CD38 + monociti (r = 0,51, p = 0,0066). I cambiamenti nelle popolazioni di monociti medi sono persistiti 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento (p = .012 per i monociti CD38 + normalizzati e p = .022 per i monociti totali normalizzati: Tabella S1) e l'aumento dell'LMR è rimasto molto significativo anche a 18 mesi.
Le cellule T CD8 positive alla PD ‐ 1 ‐ sono diminuite significativamente con il trattamento (Figura 4d). Gating su cellule T naïve, siamo stati in grado di rilevare aumenti significativi delle cellule T CD4 naïve e CD8 naïve (Figura 4e – f) e un aumento significativo (p = .017) della percentuale di cellule CD31 + CD45RA + CD4 + (Recenti emigranti timici CD4 o RTE) nel corso del trattamento (correlazione lineare, Figura S1). Non abbiamo rilevato cambiamenti consistenti nelle cellule T senescenti misurate né come cellule CD57 + né come cellule CD28. Tuttavia, abbiamo rilevato un aumento significativo dei livelli sierici di FGF ‐ 21 (Figura S2).
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| FIGURA 4 Risposte immunologiche al trattamento. (a) Diminuire (~ 35%) in percentuale di monociti (CD33 + cellula) con il trattamento. Quando normalizzato al basale, il declino dei monociti è rimasto significativo anche a 18 mesi (p = 0,022; Tabella S1). (b) Declino persistente (~ 40%) dal basale [(CD38 + monociti) 0] in CD38 + monociti con trattamento. (c) Aumento persistente del rapporto tra linfociti e monociti. Punti neri: rapporto linfociti-monociti; punti gialli: rapporto linfociti-a-CD38 + monociti. (d) Diminuzione della percentuale normalizzata di cellule CD8 PD-1 ‐ positive con il trattamento. (e) Aumento delle cellule CD4 naïve normalizzate (nCD4) rispetto al basale [(nCD4) 0] con il trattamento. (f) Aumento delle cellule CD8 naïve normalizzate con il trattamento. Punti neri: tutti i volontari (p = .03 a 9 mesi). Punti gialli: tutti i volontari meno il valore più estremo della figura 3a – c (rappresentata da stelle blu in quelle figure): p = .04 a 9 mesi e p <.03 a 12 mesi. |
TABELLA 1 Caratteristiche di invecchiamento epigenetico della popolazione in studio
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| Nota: EA = età epigenetica; A = età cronologica; 0 = a zero mesi (inizio prova); 9, 12, 18 = a 9, 12 e 18 mesi dopo l'inizio del processo; A0 = età all'esordio della prova; tutti i risultati forniti in anni o anni all'anno. |
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| FIGURA 5 Cambiamenti indotti dal trattamento nell'età epigenetica. EA, età epigenetica; A, età cronologica; modifiche illustrate rispetto a EA ‐ A prima del trattamento [(EA ‐ A) 0]. (a) Diminuire nell'età epigenetica di Horvath di 12 mesi di trattamento. Complessivamente, le analisi lineari a modello misto (LMMA) hanno indicato un valore P di .0009 nei mesi 0–12 e .018 nei mesi 0–18. (b) Diminuire in PhenoAge di 12 mesi di trattamento. I valori P complessivi di LMMA sono 0,0000 per i mesi 0–12 e 0,028 per i mesi 0–18. (c) Diminuire nell'età epigenetica di Hannum di 12 mesi e continuare la regressione dell'età epigenetica a 18 mesi. LMMA p = .012 per i mesi 0–12 e p = .0092 per i mesi 0–18. (d) Persistente declino nell'età di GrimAge tra 12 e 18 mesi. LMMA ha mostrato p = .0049 per i mesi 0–12 e p = .0016 per i mesi 0–18. (e) Media di tutti e quattro i risultati dell'orologio di invecchiamento epigenetico, che indica una significativa regressione globale dell'invecchiamento epigenetico nei mesi di prova 9–18. Con LMMA, p = .0003 per 0–12 mesi e .0016 per 0–18 mesi. (f) Variazione significativa (p <.005) del tasso di variazione di [(EA ‐ A) - (EA ‐ A) 0] tra 0-9 mesi di trattamento (tracciata a 9 mesi) e 9-12 mesi di trattamento (tracciato a 12 mesi). |
2.4 | Regressione dell'età epigenetica
Sebbene, in media, le età epigenetiche volontarie di prova (EA) fossero inferiori alle loro età cronologiche (As) al basale [(EA ‐ A) 0 <0, Tabella 1], l'età epigenetica è stata tuttavia significativamente ridotta dal trattamento in base ai risultati di tutti e quattro gli orologi epigenetici (Figura 5a-d), con una variazione media di EA ‐ A dopo 12 mesi di circa 2,5 anni (Figura 5e).
L'effetto del trattamento sulla regressione dell'età epigenetica a 12 mesi non dipendeva dall'età all'inizio del trattamento o da (EA ‐ A) 0 (Tabella 1). L'analisi lineare a modello misto (LMMA) ha mostrato livelli di significatività per i singoli orologi che vanno da p = .0009 – .012 nei mesi 0–12 a p = .0016 – .028 per i mesi 0–18 (Figura 5 legenda). I risultati di LMMA dell'orologio di Horvath sono rimasti invariati (p = 0,018) dopo essersi aggiustati per i cambiamenti nella composizione delle cellule del sangue (conta dei linfociti, percentuale di cellule T CD8 senescenti tra le cellule T CD8 e LMR). Sebbene ci sia stata una tendenza generale per EA-A a tornare indietro verso (EA-A) 0 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento, questa tendenza era incompleta, lasciando in media un miglioramento di oltre 1,5 anni al mese di prova 18 (Figura 5e, p <.001). Inoltre, l'orologio GrimAge, che è specificamente in grado di prevedere l'aspettativa di vita umana (Lu et a., 2019), non ha mostrato alcuna regressione di (EA ‐ A) - (EA ‐ A) 0 dopo il trattamento, con un guadagno di circa 2,1 restano ancora 12 anni al mese di prova 18 (Figura 5d; Tabella 1). Inoltre, il confronto tra i tassi di regressione dell'invecchiamento tra 0-9 e 9-12 mesi ha mostrato che, per ogni stimatore dell'età, il tasso di regressione dell'invecchiamento sembrava accelerare sostanzialmente con l'aumentare del tempo di trattamento (Figura 5a-d e Tabella 1), con un pendenza media su tutti e quattro gli orologi da −1,56 ± 0,46 anni / anno nei primi 9 mesi a −6,48 ± 0,34 anni / anno negli ultimi 3 mesi di trattamento (p <0,005, Figura 5f).
3 | DISCUSSIONE
Lo studio TRIIM è stato progettato per studiare la possibilità di rigenerazione del timo e l'inversione delle tendenze immunosenescenti negli uomini sani che invecchiano minimizzando gli effetti collaterali e tutti i possibili rischi. I nostri risultati supportano la fattibilità di questo obiettivo, ma inaspettatamente portano anche alla luce prove solide che la regressione di molteplici aspetti e biomaker dell'invecchiamento è possibile nell'uomo. Queste due osservazioni possono essere correlate.
La rigenerazione e la riattivazione del timo mediante la somministrazione dell'ormone della crescita sono state stabilite nei ratti e nei cani aginici attraverso il ripristino dell'istologia timica giovanile (Goff, Roth, Arp, e al., E., 1987; Kelley et al., 1986) e per inversione di età Deficit immunitari correlati (Kelley et al., 1986). Nell'uomo, l'esistenza del tessuto timico sopravvissuto dopo i 54 anni di età, necessaria per il successo della rigenerazione del timo negli individui più anziani, è stata messa in discussione (Simanovsky, Hiller, Loubashevsky e Rozovsky, 2012). Rapporti disponibili che indicano un aumento della densità timica di CT e miglioramenti immunologici indotti da rhGH nei pazienti con HIV (Napolitano et al., 2008; Plana et al., 2011), i cui timi sono fisiologicamente inusuali (McCune et al., 1998), non parlano se la rigenerazione è stata osservata in soggetti di età superiore ai 50 anni. Il presente studio ora stabilisce prove altamente significative della rigenerazione timica negli uomini in età normale accompagnati da miglioramenti in una varietà di fattori di rischio di malattia e parametri immunologici correlati all'età, nonché significative correlazioni tra TFFF e cambiamenti favorevoli nelle percentuali di monociti e LMR, indipendentemente dall'età fino a 65 anni all'inizio del trattamento. Queste osservazioni sono coerenti con la nota capacità dell'ormone della crescita di stimolare l'ematopoiesi e la proliferazione delle cellule epiteliali timiche (Savino, 2007). La nostra scoperta di un aumento dei livelli di FGF-21 dopo 12 mesi di trattamento suggerisce che la rigenerazione timica del presente trattamento può essere mediata in parte da questa citochina (Youm, Horvath, Mangelsdorf, Kliewer e Dixit, 2016), che riteniamo sia una nuova scoperta.
Non abbiamo trovato studi precedenti che associano la somministrazione di rhGH a un LMR aumentato o a livelli di monociti ridotti, mentre la somministrazione di DHEA può effettivamente aumentare i livelli di monociti (Khorram, Vu e Yen, 1997). I meccanismi coinvolti non sono chiari, ma l'effetto imprevisto del nostro trattamento sull'LMR può essere di notevole significato, per due motivi.
In primo luogo, LMR più elevate sono associate a prognosi migliori per una varietà di principali fonti di mortalità umana, tra cui almeno 8 tipi di cancro (ad esempio, cancro alla prostata; Caglayan et al., 2019), aterosclerosi (Gong et al., 2018), malattie cardiovascolari (Ji et al., 2017) e ictus (Ren, Liu, Wang, & Gao, 2017)] e sono anche associati a infiammazioni meno generalizzate (Gong et al., 2018). La protezione dalle malattie cardiovascolari è stata associata a un LMR superiore a 5 (Gong et al., 2018). Nel nostro studio, le LMR medie volontarie erano inferiori a 5 al basale ma erano ben superiori a 5 alla fine del trattamento e 6 mesi dopo la fine del trattamento.
In secondo luogo, la grande maggioranza dei monociti è CD38 positiva.
Il CD38 è un ectoenzima NADase e un degradatore del precursore NAD +, nicotinamide mononucleotide e un aumento dell'espressione del CD38 con l'età sembra essere la causa primaria dell'esaurimento del tessuto NAD + correlato all'età nei topi e molto probabilmente anche nell'uomo (Camacho-Pereira et al ., 2016). È stato proposto che l'induzione del CD38 con l'invecchiamento sia guidata dall'infiammazione legata all'età e che abbia origine nelle cellule infiammatorie residenti nei tessuti (Camacho-Pereira et al., 2016), che in linea di principio potrebbero includere i monociti. Sebbene molte altre cellule immunitarie esprimano CD38, non abbiamo rilevato nessun'altra popolazione di cellule immunitarie CD38 + che è diminuita in risposta al trattamento di rigenerazione del timo, suggerendo che i monociti potrebbero avere un significato particolare.
La nostra osservazione di un declino della CRP in combinazione con livelli di monociti ridotti suggerisce quindi la possibilità di un aumento dei livelli di NAD + nei tessuti. Il meccanismo con cui è stata ridotta la CRP non è chiaro, ma la riattivazione della selezione negativa nel timo potrebbe in teoria ridurre l'infiammazione autoimmune; potrebbe anche essere coinvolta l'autorizzazione di virus pronflammatori o cellule somatiche senescenti. Data la relazione tra deplezione di tessuto NAD + correlata all'età e insorgenza di fenotipi dell'invecchiamento (Das et al., 2018; Poljsak & Milisav, 2016), un aumento del contenuto di NAD + nei tessuti potrebbe essere collegato alle nostre osservazioni sull'invecchiamento epigenetico inverso, al associazione generale di LMR superiori con una migliore salute e precedenti osservazioni che collegano il trapianto di timo alla regressione di vari processi di invecchiamento non immunologico (Fabris, Mocchegiani, Muzzioli e Provinciali, 1988). Coerentemente con questa possibilità, abbiamo osservato che forti cali in totale e monociti CD38 +, aumenti di LMR e riduzione di GrimAge sono persistiti per 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento.
Il declino indotto dal trattamento nelle cellule T PD ‐ 1 + CD8 è coerente con la possibilità che il trattamento di rigenerazione del timo riprogrammi epigeneticamente le cellule T CD8 “esaurite” (TEX), una popolazione distinta PD ‐ 1 + CD8 recentemente caratterizzata (Khan et al., 2019 ). Queste cellule sono di grande interesse in parte perché il PD-1 è una molecola del checkpoint immunitario che inibisce le risposte proliferative delle cellule T (Henson, Macaulay, Franzese e Akbar, 2012) ed è coinvolto nell'evasione del cancro del controllo immunitario, portando a intensi sforzi sviluppare inibitori del checkpoint immunitario farmacologico mirati alla PD ‐ 1 (Khan et al., 2019). Il blocco del segnale PD-1 migliora la proliferazione di cellule CD-8 umane "senescenti" (Henson, Macaulay, Riddell, Nunn e Akbar, 2015). Anche i topi sviluppano una sottopopolazione di cellule CD8 esauste con l'invecchiamento che sono PD ‐ 1 + e Tim ‐ 3 + (Lee et al., 2016). Pertanto, la riduzione delle cellule T PD ‐ 1 + CD8 con il trattamento di rigenerazione del timo rappresenta probabilmente un miglioramento significativo dello stato immunitario.
Gli aumenti indotti dal trattamento delle cellule T CD4 naïve e CD8 naïve erano relativamente piccole rispetto ai cambiamenti riportati nei pazienti con HIV trattati con rhGH, ma la nostra popolazione di volontari era pre-immunosensibile e non impoverita di cellule T CD4 naïve e CD8 naïve al basale.
Si sono anche verificate risposte positive nonostante le potenziali complicanze causate dall'invecchiamento dei linfonodi (Thompson et al., 2019). Pertanto, i piccoli aumenti osservati in queste cellule e negli RTE delle cellule T CD4 sono coerenti con l'obiettivo finale di prevenire o invertire il normale collasso del repertorio TCR correlato all'età a età appena superiori a quelle della nostra popolazione di studio (Naylor et al. , 2005).
Ci possono essere meccanismi sia immunologici che non immunologici di inversione epigenetica dell'invecchiamento. GH, DHEA e metformina hanno effetti unici che sono in opposizione all'invecchiamento ed è possibile che la combinazione specifica di questi agenti attivi una gamma sufficientemente ampia di percorsi terapeutici per tenere conto dell'inversione precedentemente imprevedibile dell'invecchiamento epigenetico, anche indipendentemente dal marcatori immunologici che abbiamo misurato.
A questo proposito, va sottolineato che GH e IGF ‐ 1 possono anche avere effetti pro-invecchiamento e che quindi la maggior parte dei gerontologi preferisce ridurre piuttosto che aumentare i livelli di questi fattori (Longo et al., 2015). Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti sull'invecchiamento e sulla GH / IGF-1 sono confusi dall'uso di mutazioni che influenzano la programmazione dello sviluppo dell'invecchiamento, che non è necessariamente rilevante per gli adulti non mutanti. Ad esempio, tali mutazioni nei topi alterano la normale innervazione dell'ipotalamo durante lo sviluppo del cervello e prevengono l'infiammazione ipotalamica nell'adulto (Sadagurski et al., 2015) che può programmare l'invecchiamento in tutto il corpo adulto nei non mutanti (Zhang et al., 2017) . Sembra improbabile che l'abbassamento dell'IGF-1 negli adulti normali non mutanti possa fornire gli stessi effetti protettivi. Un secondo problema con gli studi precedenti è un fallimento generale nel disaccoppiare la segnalazione di GH / IGF ‐ 1 da cambiamenti permanenti nella segnalazione dell'insulina. La longevità umana sembra essere collegata in modo più coerente alla sensibilità all'insulina rispetto ai livelli di IGF-1 e gli effetti dell'IGF-1 sulla longevità umana sono confusi dalla proporzionalità inversa alla sensibilità all'insulina (Vitale, Pellegrino, Vollery e Hofland, 2019). Riteniamo pertanto che il nostro approccio all'aumento di GH / IGF-1 per un periodo di tempo limitato nel contesto più naturale di DHEA elevato, pur massimizzando la sensibilità all'insulina sia giustificato, in particolare alla luce del ruolo positivo di GH e IGF-1 nel mantenimento immunitario, il ruolo del mantenimento immunitario nel ritardo dell'invecchiamento (Fabris et al., 1988) e dei nostri risultati attuali.
Qualunque sia il meccanismo dell'inversione dell'età epigenetica, i quattro orologi epigenetici selezionati, nonostante misurino in qualche modo diverse caratteristiche dell'invecchiamento e siano correlati in modo diverso con la composizione del sangue e la lunghezza dei telomeri dei leucociti, hanno tutti mostrato una significativa regressione dell'età epigenetica. C'è stata anche una marcata accelerazione dell'inversione dell'invecchiamento epigenetico dopo 9 mesi di trattamento. Le implicazioni di quest'ultima osservazione restano da esplorare. Inoltre, sebbene l'inversione dell'invecchiamento epigenetico sembrasse regredire parzialmente dopo l'interruzione del trattamento secondo alcuni orologi epigenetici, ciò non era vero per l'orologio GrimAge, che predice meglio l'aspettativa di vita umana e la durata della salute (Lu et al., 2019). Resta da vedere se le misurazioni di follow-up dell'invecchiamento epigenetico usando l'orologio GrimAge mostreranno un persistente guadagno di 2 anni nell'aspettativa di vita prevista o una perdita graduale dell'aspettativa di vita aumentata rispetto al basale. In quest'ultimo caso, sarà interessante determinare se la ripetizione o il prolungamento del trattamento di prova potrebbero ripristinare o aumentare ulteriormente il guadagno previsto per la durata della vita.
Sebbene l'età epigenetica non misuri tutte le caratteristiche dell'invecchiamento e non sia sinonimo di invecchiamento stesso, è la misura più accurata dell'età biologica e del rischio di malattie legate all'età disponibili oggi.
Ciò giustifica l'uso di orologi epigenetici per stimare l'efficacia degli interventi di invecchiamento putativo su un calendario pratico. Il presente studio sostiene fortemente questo approccio, avendo dimostrato la regressione dell'età epigenetica con un alto significato statistico anche in uno studio pilota di un anno che ha coinvolto solo 9 volontari. Tuttavia, sarà necessario verificare i risultati attuali replicandoli in uno studio di follow-up adeguatamente potenziato. Anche se resta ancora molto da fare, le prospettive generali per un significativo miglioramento dell'invecchiamento umano sembrano essere molto promettenti.
4 | PROCEDURE SPERIMENTALI
4.1 | Reclutamento e selezione volontari
Dieci uomini adulti nominalmente sani dai 51 ai 65 anni sono stati reclutati per lo studio con il passaparola a seguito di annunci pubblici sugli obiettivi del processo. C'erano due coorti, la prima composta da sette uomini e la seconda composta da tre uomini. La coorte 1 è stata trattata da ottobre 2015 a ottobre 2016 e la coorte 2 è stata trattata da aprile 2016 ad aprile 2017.
I volontari hanno prima compilato un questionario di screening online e i candidati qualificati hanno quindi fornito un campione di sangue per la conferma obiettiva dell'ammissibilità alla salute. I candidati che hanno superato la seconda schermata hanno partecipato a una riunione per consentire la valutazione fisica, la verifica della capacità di autoiniezione di rhGH, l'imaging di risonanza magnetica basale (MR) del timo, due ulteriori raccolte di sangue (vedere Appendice S2), il consenso informato e istruzioni su come compilare i diari terapeutici forniti intesi a ricordare ai volontari gli schemi di dosaggio e a segnalare eventuali effetti avversi o irregolarità nel dosaggio.
4.2 | Condotta di prova
Il processo TRIIM è stato condotto dopo l'approvazione del protocollo di studio da parte dell'Aspire Institutional Review Board (Santee, California) e sotto gli auspici dell'IND 125851 della Food and Drug Administration. I volontari hanno ricevuto esami di risonanza magnetica presso il Lucas Center for Imaging, raccolte di sangue presso lo Stanford Blood Center e analisi CyTOF da parte del Human Immune Monitoring Center (HIMC) sotto l'approvazione dell'Ufficio di conformità della ricerca dell'Università di Stanford. Lo studio è stato condotto in modo coerente con la Dichiarazione di Helsinki, Protezione dei volontari umani (21 CFR 50), Commissioni di revisione istituzionale (21 CFR 56) e Obblighi degli investigatori clinici (21 CFR 312). In base alle linee guida FDA per gli studi esplorativi pre-fase I (https: // prsin fo.clini caltr ials.gov/ACT_Check list.pdf), non è stato preregistrato su clinictrials.gov.
Durante la prima settimana di sperimentazione, è stato somministrato solo rhGH (0,015 mg / kg) per ottenere una risposta iniziale all'insulina e durante la seconda settimana, rhGH è stato combinato con 50 mg di DHEA per valutare la soppressione dell'insulina dal solo DHEA. Durante la terza settimana, le stesse dosi di rhGH e DHEA sono state combinate con 500 mg di metformina.
A partire dalla quarta settimana, tutte le dosi sono state individualizzate in base alle risposte particolari di ciascun volontario. Successivamente, il sangue è stato raccolto una settimana prima dei mesi di prova 2, 3, 4, 6 e 9 per consentire ulteriori aggiustamenti della dose in quei momenti (per massimizzare l'IGF-1 e ridurre al minimo l'insulina) e sono stati ottenuti campioni di sangue aggiuntivi a 12 mesi per concludere il periodo di monitoraggio del trattamento. La conformità del dosaggio è stata verificata dalla risposta di IGF-1, DHEAS e insulina alla somministrazione di rhGH, DHEA e metformina, rispettivamente; mediante frequenti comunicazioni con volontari di prova; e mediante revisione retrospettiva dei diari dei farmaci restituiti. Ulteriori esami del sangue di follow-up sono stati effettuati a 18 mesi per la coorte 1; la coorte 2 non era disponibile. In casi selezionati, come ritenuto utile, il prelievo di sangue supplementare è stato effettuato altre volte.
Le cellule mononucleate del siero e del sangue periferico (PBMC) sono state crioconservate presso l'SBC, in quest'ultimo caso usando il 10% di dimetilsolfossido e siero bovino fetale (FBS), e conservate lì e poi presso l'HIMC fino alla fine dello studio per consentire il CyTOF simultaneo analisi e ulteriore distribuzione di alcuni campioni ad altri centri.
Quest Diagnostics ha eseguito emocromo completo per consentire la correzione delle perdite cellulari causate da congelamento e scongelamento o altri fattori, ma in generale, la necessità di correzione è stata evitata riportando i sottogruppi di cellule come percentuali delle loro popolazioni di riferimento (ad esempio, cellule CD4 naïve come una percentuale del totale delle cellule CD4) e aprendo per intarsi singoletti vitali. Altre analisi del sangue sono descritte nell'appendice S2.
rhGH (Omnitrope, Sandoz) è stato fornito a volontari di prova ed è stato auto-somministrato 3-4 volte a settimana, a seconda degli effetti collaterali, prima di coricarsi insieme ad altri farmaci di studio. Tutti i volontari hanno anche ricevuto e chiesto di assumere integratori di 3000 UI di vitamina D3 e 50 mg di zinco elementare al giorno.
4.3 | Imaging e analisi RM
Tutte le scansioni di imaging sono state eseguite sullo stesso scanner MRI Premier Premier 3T presso il Lucas Center for Imaging presso la Stanford University.
Metodi standardizzati per determinare quantitativamente il contenuto di grasso timico non sono stati precedentemente descritti, quindi abbiamo impiegato una metodologia computazionale che è stata precedentemente applicata all'analisi del contenuto di grasso del midollo osseo (Hu, Nayak e Goran, 2011). Questi metodi per la quantificazione del grasso hanno dimostrato di essere più accurati della valutazione istopatologica standard mediante biopsia (Fischer et al., 2012) e forniscono la frazione di grasso timico (TFF) come numero dallo 0% al 100%. La TFF è stata determinata in tre regioni timiche centrali replicate in ciascun punto temporale testato ed è stata utilizzata per calcolare la frazione priva di grasso timico (TFFF) come 100% - TFF. Gli stessi metodi sono stati applicati anche per determinare la frazione fatree del midollo osseo sternale (BMFFF). Per maggiori dettagli, consultare l'Appendice S2.
4.4 | immunofenotipizzazione
I PBMC crioconservati sono stati scongelati in mezzi caldi, lavati due volte e risospesi in tampone CyFACS (PBS integrato con 2% BSA, 2 mM EDTA e 0,1% sodio azide). La vitalità è stata determinata dall'esclusione del colorante blu di tripan (dosaggio Vi ‐ CELL XR, Beckman Coulter Life Sciences). Le cellule sono state aggiunte a una micropiastra con fondo a V (1,5 × 106 cellule vitali / pozzetto) e lavate una volta mediante pellettizzazione e risospensione in tampone CyFACS fresco. Le cellule sono state colorate per 60 minuti su ghiaccio con 50 microlitri di un cocktail di anticorpi marcati con isotopi di metalli pesanti diretti contro 35 marcatori di superficie cellulare (per i dettagli e per dettagli su lavaggio delle cellule, colorazione, permeabilizzazione e gating, vedere Appendice S2) .
4.5 | Determinazione dell'età epigenetica
Lo stato della metilazione del DNA genomico è stato determinato in PBMC precedentemente crioconservati presso il Center for Molecular Medicine and Therapeutics presso la University of British Columbia. Il DNA genomico è stato estratto con il DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germania) e la conversione del bisolfito del DNA estratto è stata eseguita utilizzando un kit di metilazione del DNA Zymo EZ (Zymo Research, Irvine, CA). L'analisi della metilazione del DNA (DNAm) è stata eseguita utilizzando l'Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip (Illumina, San Diego, CA), che misura i livelli di DNAm con risoluzione singola-CpG a 866.836 siti CpG nel genoma umano. La metilazione in siti specifici è stata calcolata come β = Max (M, 0) / [Max (M, 0) + Max (U, 0)], dove Max (M, 0) è l'intensità di fluorescenza degli alleli metilati (M) ( segnale A) e Max (U, 0) è la fluorescenza degli alleli non metilati (U) (segnale B). Pertanto, i valori β vanno da 0 (completamente non metilato) a 1 (completamente metilato) (Dunning, Barbosa-Morais, Lynch, Tavare e Ritchie, 2008).
Gli "orologi" epigenetici specifici scelti per l'uso in questo studio sono stati quelli derivati da Horvath (2013; DNAm age), Hannum et al. (2013; DNAm age H), Levine et al. (2018; DNAm PhenoAge) e Lu et al. (2019; DNAm age G o “GrimAge”). Le motivazioni specifiche per queste scelte sono basate su Horvath e Levine (2015), Marioni et al. (2015) e Triche, Weisenberger, van den Berg, Laird e Siegmund, (2013) e sono descritti nell'Appendice S2.
Abbiamo calcolato gli effetti dell'intervento sull'età epigenetica adattando prima tutti i dati temporali su un modello lineare a effetti misti per dati longitudinali (prelievi di sangue multipli dalla stessa persona, aggiustati per l'età iniziale del DNAm) per seguire le tendenze globali dell'invecchiamento epigenetico. In secondo luogo, per isolare cambiamenti individuali e specifici del tempo più dettagliati, abbiamo calcolato il cambiamento nell'età epigenetica rispetto all'età cronologica per ciascun volontario come (EA ‐ A) - (EA ‐ A) 0 come descritto nel testo, dove EA è l'epigenetico l'età all'età cronologica A e (EA ‐ A) 0 è la differenza di base tra EA e A.
4.6 | analisi statistica
Abbiamo usato la regressione lineare ad effetti misti per spiegare correttamente la natura longitudinale delle informazioni (estrazioni multiple dalla stessa persona). Quando la correzione per il tempo non era necessaria, abbiamo usato le normali regressioni lineari o non lineari. Per i confronti tra pretrattamento e specifici endpoint post-trattamento, abbiamo impiegato il test t, il test t per confronti accoppiati o le alternative selezionate da SigmaPlot quando le ipotesi alla base dei test t non erano giustificate. Per consentire confronti normalizzati a baseline zero del mese, sono stati calcolati i risultati replicati per ciascun volontario al momento zero e ogni risultato replicato è stato diviso per la media per produrre una popolazione di partenze dal 100% che potrebbe quindi essere utilizzata per il confronto con punti temporali successivi. I valori di P riportati non sono corretti per confronti multipli poiché nella maggior parte dei casi non sono stati condotti test di ipotesi indipendenti e, nel caso di entrambi i test multipli per età epigenetica e differenze significative nei risultati CyTOF, tutti i risultati dei test significativi sono stati altamente correlati, rendendo la correzione di Bonferroni eccessivamente conservatore.
RINGRAZIAMENTI
Siamo grati per il supporto poliedrico di Garry Nolan e Sean Bendall. Apprezziamo molto l'utile consulenza e il supporto forniti da Yael Rosenberg-Hasson dell'HIMC e la felice collaborazione di molte altre persone presso l'HIMC, il Lucas Center for Imaging, l'SBC e altre istituzioni del campus di Stanford che hanno permesso l'elaborazione volontaria e seminari nel campus.
Ringraziamo anche i revisori di questo documento, che ci hanno aiutato a migliorare il manoscritto in modi importanti. Siamo particolarmente grati per le generose donazioni personali fornite da molte persone e per una sovvenzione supplementare della Life Extension Foundation, che ha permesso di effettuare ulteriori misurazioni. Lo studio è stato supportato da Intervene Immune, Inc.
CONFLITTO D'INTERESSE
GMF, RTB, JPW e SH sono azionisti o hanno opzioni per l'acquisto di azioni di Intervene Immune, Inc. GMF e RTB sono funzionari di Intervene Immune e sono indicati in una relativa domanda di brevetto di Intervene Immune. Tutti gli altri autori non dichiarano interessi in conflitto.
CONTRIBUTI D'AUTORE
GMF ha progettato e diretto lo studio, compilato i dati per tutta la grafica, preparato la grafica e scritto il manoscritto. RTB ha gestito lo studio; ha contribuito al suo design; ottenuto dati digitali per tutte le analisi CyTOF, TFFF e BMFFF; e ha contribuito al manoscritto. JPW ha prestato servizio come medico di studio, fornendo supervisione medica, supporto, consulenza e valutazione di volontari e assistito con eventi di prova. ZG ha progettato e organizzato il pannello anticorpale per l'analisi CyTOF, ha diretto le analisi CyTOF e ha collaborato agli eventi di prova. SSV ha progettato le tecniche di misurazione TFFF e BMFFF. HM e ML hanno fornito una guida per il corretto trattamento e interpretazione dei dati CyTOF e hanno rivisto e approvato la nostra metodologia CyTOF.
DTSL e MSK hanno eseguito tutte le misurazioni epigenetiche e fornito informazioni utili per il manoscritto. SH ha eseguito tutti i calcoli dell'orologio epigenetico, ha eseguito tutte le correlazioni lineari a modello misto e ha contribuito al manoscritto. Tutti gli autori hanno approvato il manoscritto.
ORCID
Gregory M. Fahy https://orcid.org/0000-0003-0445-7385
Robert T. Brooke http://orcid.org/0000-0001-8492-5198
Zinaida Good https://orcid.org/0000-0003-2343-5771
Shreyas S. Vasanawala http://orcid.org/0000-0002-1999-6595
Michael D. Leipold http://orcid.org/0000-0001-5389-0906
David T. S. Lin http://orcid.org/0000-0001-5695-9446
Michael S. Kobor http://orcid.org/0000-0003-4140-1743
Steve Horvath http://orcid.org/0000-0002-4110-3589
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INFORMAZIONI DI SUPPORTO
Ulteriori informazioni di supporto sono disponibili online nella sezione Informazioni di supporto alla fine dell'articolo.
Come citare questo articolo: Fahy GM, Brooke RT, Watson JP, et al. Inversione dell'invecchiamento epigenetico e tendenze immunosenescenti nell'uomo. Cell invecchiamento. 2019; 00: e13028. https://doi.org/10.1111/acel.13028
Traduzione: Megachirottera
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