MEGACHIROTTERA

Analisi chemiometriche dei cannabinoidi: 

chemiotassonomia e sindrome da domesticazione 

E. M. Mudge1,2, S. J. Murch 1 e P. N. Brown2,3

(2018) 8:13090 | DOI:10.1038/s41598-018-31120-2

Astratto

La cannabis è un'interessante coltura domestica con una lunga storia di coltivazione e uso. I ceppi sono stati selezionati attraverso programmi di allevamento informali con genitori e criteri non divulgati. Il termine "ceppo" si riferisce a differenze morfologiche minori e al marchio del coltivatore piuttosto che a varietà coltivate distinte. Abbiamo ipotizzato che i ceppi venduti da diversi produttori autorizzati siano indistinguibili chemiotassonomicamente e che la pratica commerciale di identificare i ceppi in base al rapporto tra THC totale e CBD sia insufficiente per tenere conto dei risultati sulla salute umana riportati. Abbiamo usato la metabolomica mirata per analizzare 11 cannabinoidi noti e un approccio metabolomico non mirato per identificare 21 cannabinoidi sconosciuti. Cinque gruppi di ceppi chemiotassonomicamente indistinguibili sono stati identificati dai 33 prodotti commerciali. Solo 3 dei cluster producono CBDA in quantità significative mentre gli altri 2 cluster reindirizzano le risorse metaboliche verso i percorsi di produzione del THCA. Sei metaboliti sconosciuti erano unici per i ceppi ricchi di CBD e/o correlati al CBDA e 3 incogniti sono stati trovati solo nei ceppi ricchi di THC. Insieme, questi dati indicano che l'addomesticamento del germoplasma della cannabis ha comportato una perdita del percorso CBDA in alcuni ceppi e la riallocazione delle risorse tra i percorsi CBDA e THCA in altri. L'impatto dell'addomesticamento è la mancanza di diversità chimica e la perdita di biodiversità nelle moderne varietà di cannabis. Sei metaboliti sconosciuti erano unici per i ceppi ricchi di CBD e/o correlati al CBDA e 3 incogniti sono stati trovati solo nei ceppi ricchi di THC. Insieme, questi dati indicano che l'addomesticamento del germoplasma della cannabis ha comportato una perdita del percorso CBDA in alcuni ceppi e la riallocazione delle risorse tra i percorsi CBDA e THCA in altri. L'impatto dell'addomesticamento è la mancanza di diversità chimica e la perdita di biodiversità nelle moderne varietà di cannabis. Sei metaboliti sconosciuti erano unici per i ceppi ricchi di CBD e/o correlati al CBDA e 3 incogniti sono stati trovati solo nei ceppi ricchi di THC. Insieme, questi dati indicano che l'addomesticamento del germoplasma della cannabis ha comportato una perdita del percorso CBDA in alcuni ceppi e la riallocazione delle risorse tra i percorsi CBDA e THCA in altri. L'impatto dell'addomesticamento è la mancanza di diversità chimica e la perdita di biodiversità nelle moderne varietà di cannabis.

Introduzione

La cannabis sativa L. (marijuana) è una pianta dioica annuale dell'Asia centrale che è stata utilizzata in medicina e ricreativamente per migliaia di anni 1 . L'addomesticamento della cannabis ha incluso la selezione umana, la consanguineità e l'allevamento incrociato nonché l'outcrossing naturale e la miscelazione del genoma 1. I ceppi non sono facilmente delineati dal genotipo e sono state osservate solo correlazioni moderate tra la progenie C. indica e C. sativa . Inoltre, è stata osservata una grande varianza genetica nei ceppi 2, 3 identici . I programmi standardizzati e altamente controllati per l'allevamento di varietà o cultivar d'élite mediante selezione del profilo fitochimico sono stati limitati 4, 5 . Si stima che ci siano diverse centinaia o forse migliaia di ceppi di cannabis attualmente coltivati ​​in mercati legali e illegali 4 . È possibile che materiali vegetali identici chimicamente o strettamente correlati vengano venduti con nomi diversi da produttori diversi e non esiste una definizione chiara del concetto di "ceppo".

I produttori di cannabis commercializzano i loro prodotti in base alla quantità totale di Δ9-tetraidrocannabinolo (THC) e cannabidiolo (CBD) con il presupposto che la composizione fitochimica complessiva del materiale possa essere estrapolata da questi valori, ma ci sono prove aneddotiche considerevoli che suggeriscono che i ceppi con contenuto di THC/CBD simile ha effetti diversi sulla fisiologia umana 6, 7 . Più di 120 cannabinoidi diversi sono stati descritti nella cannabis 8, 9 con la fitochimica più interessante trovata nei tricomi ghiandolari sui fiori delle infiorescenze femminili 10 . Il THC è il cannabinoide più studiato e ci sono altre dieci classi di cannabinoidi con strutture chimiche variabili 8. I cannabinoidi sono sintetizzati in forme acide attraverso la condensazione di geranil difosfato (GPP) e più comunemente acido olivetolico, prodotti dei metileritritol fosfato (MEP) e vie polichetidiche 11, 12 . Esistono diversi altri polichetidi che possono essere utilizzati al posto dell'acido olivetolico, che contribuiscono all'ampia variazione all'interno di questa classe chimica 13, 14 . I cannabinoidi neutri sono prodotti di decarbossilazione derivanti dalla lavorazione e dalla manipolazione dei fiori raccolti.

I modelli chemiometrici vengono utilizzati per valutare i set di dati dei metaboliti per delineare le relazioni e identificare le potenziali influenze sulla diversità fitochimica 15, 16, 17 . Questi approcci possono essere classificati come analisi mirate, scoperta fitochimica non mirata, profilazione metabolomica o impronte digitali 15 . La metabolomica mirata determina le differenze nei fitochimici noti mentre gli approcci non mirati valutano i composti non identificati nei profili fitochimici 15 . Approcci mirati-non mirati combinano metaboliti noti con set di dati non mirati come strumento di generazione di ipotesi per scoprire relazioni metaboliche, cluster, famiglie e percorsi biochimici 15, 18. L'uso di questi modelli e algoritmi consente una migliore comprensione della comunanza e della diversità dei metaboliti all'interno delle specie vegetali 19 .

Abbiamo ipotizzato che il contenuto totale di THC e CBD non sia sufficiente per distinguere i ceppi e che una combinazione di approcci chemometrici mirati e non mirati possa essere utilizzata per prevedere la composizione dei cannabinoidi e per comprendere meglio l'impatto del programma di selezione informale e la selezione sulla diversità fitochimica della cannabis . Per indagare su queste ipotesi, abbiamo assemblato una raccolta di ceppi di cannabis venduti dai produttori autorizzati in Canada principalmente in base al contenuto totale di THC/CBD e abbiamo analizzato i ceppi di cannabinoidi noti utilizzando un metodo analitico precedentemente convalidato 20 per stabilire gruppi di materiali vegetali simili.

Abbiamo quindi utilizzato un approccio metabolomico non mirato per identificare composti e relazioni chimiche precedentemente non caratterizzati. Abbiamo identificato 5 gruppi di ceppi chemiotassonomicamente indistinguibili all'interno della collezione. I nostri risultati mostrano che la variazione dei cannabinoidi meno abbondanti tra i ceppi di cannabis non dipendeva dal contenuto totale di THC e CBD. Questi dati suggeriscono che l'addomesticamento del germoplasma della cannabis ha comportato la perdita del percorso CBDA in alcuni ceppi e la riallocazione delle risorse tra i percorsi CBDA e THCA in altri.

Risultati

Metabolomica mirata dei cannabinoidi

Due cannabinoidi per i quali sono stati ottenuti gli standard, CDBV e CBL, non sono stati rilevati in nessun ceppo. Gli 11 cannabinoidi rimanenti con standard chimici di riferimento disponibili sono stati identificati e quantificati. Il contenuto di THCA variava dallo 0,76 al 20,71% p / p, con un aumento quasi lineare del contenuto dalla deformazione più bassa a quella più alta con un r 2 di 0,97, mentre il contenuto di CBDA variava da <MDL al 18,11% p / p, con il CBDA più elevato ceppi con il più basso contenuto di THCA (Fig.  1). Nei ceppi abbondanti di THC i livelli di CBDA erano inferiori allo 0,15%, mentre nei ceppi abbondanti di CBD il contenuto era maggiore del 5%. THC, la forma decarbossilata di THCA era presente nei ceppi da <LOQ fino al 2% in peso in alcuni ceppi, mentre il contenuto di CBD variava da <MDL allo 0,8%. Il CBD era prevalente nei ceppi di CBDA elevati. Inoltre, 7 cannabinoidi presenti a livelli inferiori sono stati quantificati utilizzando standard di calibrazione individuali: THCV, CBG, CBN, CBC, CDBVA, CBGA e Δ8-THC.

Fig. 1 Via biosintetica dei cannabinoidi originati dall'acido olivetolico e dal pirofosfato di geranile. I grafici descrivono il contenuto di cannabinoidi all'interno dei 33 ceppi ottenuti disposti dal THC più basso al più alto totale.

Classificazione dei ceppi

Abbiamo ipotizzato che i singoli allevatori di piante selezionati per i ceppi di cannabis mediante la regolazione e la down-regolazione degli enzimi specifici all'interno delle vie biosintetiche con conseguente reindirizzamento dei metaboliti tra THCA e CBDA. La nostra analisi dei dati ha identificato 5 gruppi di ceppi che rientrano in una gamma ristretta di valori totali di CBD / THC coerenti con questa ipotesi (Tabella 1 ). Il ramo del percorso biosintetico con acido olivetolico e pirofosfato di geranile come precursori produce CBGA, CBG, CBCA, CBC, THCA, THC, CBDA e CBD (Fig. 1 ). I ceppi di tutti i cluster contenevano quantità misurabili di CBGA, CBG, THCA e THC (Fig. 1 ). Nove ceppi dei cluster con concentrazioni più elevate di THCA (blu e viola) non contenevano livelli rilevabili di CBC (Fig. 1 ). Non è stato trovato che due dei cluster contenessero quantità significative di CBDA e CBD (Fig. 1; blu e viola). Un ceppo era diverso da tutti gli altri e aveva un maggiore contenuto di CBDA e livelli rilevabili di CBGA, CBG CBC e CBD con THCA e THC minimi (Fig. 1; rosso).

Tabella 1 I ceppi di cannabis sono stati raggruppati in 5 gruppi distinti che potrebbero essere separati dal flusso di metaboliti attraverso le vie CBD e THC.

Anche i composti prodotti dai precursori dell'acido divarinolico e del pirofosfato di geranile tramite CBGVA differiscono per cluster di ceppi (Fig. 2 ). Il CBGVA sembra essere un punto di riferimento per l'allocazione delle risorse nella cannabis tra THCV e CBDVA, indicando che l'attività enzimatica o il meccanismo di allocazione delle risorse per la produzione di THCV è stato perso nel processo di allevamento di ceppi raggruppati nei gruppi rosso, arancione e verde (Fig.  2 ).

Fig. 2 Via biosintetica dei cannabinoidi originati dall'acido divarinolico e dal pirofosfato di geranile. I grafici descrivono il contenuto di cannabinoidi all'interno dei 33 ceppi ottenuti disposti dal THC più basso al più alto totale.

Analisi metabolomica non mirata

Oltre agli 11 cannabinoidi che corrispondevano a standard autentici, sono stati identificati 21 picchi nei cromatogrammi con spettri UV caratteristici dei cannabinoidi. Rispetto al THC, i contenuti sono stati stimati da <MDL fino allo 0,34% in peso. Due cannabinoidi sconosciuti (CMPD-7 e CMPD-11) sono stati rilevati in tutti i ceppi, mentre CMPD-3 e CMPD-20 sono stati rilevati solo in un singolo ceppo.

Rapporti tra cannabinoidi noti e sconosciuti

È stata tracciata un'analisi dei componenti principali (PCA) dei dati cannabinoidi scalati automaticamente per mostrare il raggruppamento dei campioni in modo non supervisionato (Fig. 3 ). Nel diagramma PCA, i primi due componenti principali (PC) hanno catturato il 36,6% della varianza nei dati. Basato sul diagramma dei caricamenti, il primo PC è stato maggiormente influenzato dal contenuto di THCA e CBDA dei ceppi, che sono correlati negativamente. Esistono due ceppi THC elevati (CAN17 e CAN21) e uno ceppo CBD (CAN34) che sono stati separati dai dati raggruppati entro il limite di confidenza del 95% della varianza totale dei dati. Basato sul grafico dei caricamenti (Fig. 3B), CAN17 e CAN21 possono essere influenzati da un numero significativo di cannabinoidi a bassa abbondanza tra cui CBGA, CMPD-12 e CMPD-11. CAN34 è probabilmente dovuto al suo contenuto significativamente più elevato di CBDA rispetto agli altri ceppi e perché conteneva meno dell'1% di THC totale.

Fig. 3 Analisi dei componenti principali (PCA) dei profili di cannabinoidi classificati in base al contenuto di THC / CBD ( a ) grafico dei punteggi ( b ) grafico dei carichi.

Mentre i primi due componenti principali della PCA descrivono il 36% della varianza, vi è un restante 64% della varianza nei cannabinoidi che non viene descritta con questo modello. Pertanto, sono stati impiegati modelli aggiuntivi per comprendere le relazioni tra cannabinoidi e per identificare ulteriori classi di deformazione in base al contenuto di questi 32 diversi cannabinoidi. L'analisi di regressione lineare multipla (MLR) ha mostrato che 14 cannabinoidi erano più adatti rispetto a tutti i cannabinoidi per predire il contenuto di THCA con valori di validazione r 2 migliorando rispettivamente da 0,02 e 0,88 e per predire il contenuto di CBDA 14 cannabinoidi miglioravano i valori di validazione r 2 da 0,49 a 0,95 rispetto all'utilizzo dell'intero set di dati.

Correlazioni di Pearson sono state utilizzate per determinare se uno qualsiasi dei cannabinoidi non identificati potesse essere associato ai principali cannabinoidi THCA, THC, CBDA e CBD (Tabella 2). Non vi era alcuna correlazione significativa tra THCA o THC e nessuno dei composti sconosciuti (Tabella 2). Il contenuto di CBDA è stato positivamente correlato con CMPD1, CBDVA, CMPD5, CMPD6. CMPD16 e CMPD18 (Tabella 2). Il CBD era potenzialmente debolmente correlato con CMPD1, CMPD6 e CBDA (Tabella 2).

Tabella 2 Coefficienti di correlazione di Pearson di tutti i cannabinoidi rispetto ai quattro principali cannabinoidi (THCA, CBDA, THC e CBD) oltre all'analisi spettrale UV che descrive i cannabinoidi come acidi o neutri.

Identificazioni e percorsi putativi

Dieci delle incognite sono state trovate su più ceppi di tutti i cluster (Fig. 4). CMPD1 era fortemente correlato con CBDA secondo la correlazione di Pearson (Tabella 2) e sebbene fosse stato trovato in molti ceppi classificati come blu o viola, era a concentrazioni molto più elevate nei cluster rosso, verde e arancione (Fig. 5a). I composti 3,5,6,15 e 18 sono stati trovati solo nei cluster ricchi di CBD rosso, verde e arancione (Fig. 5b-f). I composti 2, 12 e 20 sono stati trovati solo nei ceppi dominanti di THC (Fig. 6a-c).

Fig. 4 Cannabinoidi sconosciuti determinati dall'analisi metabolomica non mirata per essere comuni a tutti i gruppi di ceppi. ( a ) CMPD4, ( b ) CMPD7, ( c ) CMPD8, ( d ) CMPD9, ( e ) CMPD10, ( f ) CMPD11, ( g ) CMPD14, ( h ) CMPD16, ( i ) CMPD19, ( j ) CMPD21.

Fig. 5 Cannabinoidi non identificati determinati dall'analisi metabolomica non mirata per essere unici per i ceppi ricchi di CBD. ( a ) CMPD1, ( b ) CMPD3, ( c ) CMPD5, ( d ) CMPD6, ( e ) CMPD15, ( f ) CMPD18.

Fig. 6 Cannabinoidi non identificati determinati dall'analisi metabolomica non mirata per essere unici per i ceppi dominanti di THC. ( a ) CMPD2, ( b ) CMPD12, ( c ) CMPD20.

Discussione

La lunga storia dell'uso umano ha reso difficile stabilire la regione di origine esatta per la cannabis, sebbene la letteratura sostenga il Nord-est asiatico 1, 4, 21 . L'allevamento di cultivar di cannabis nell'industria della canapa si è concentrato sui miglioramenti morfologici attraverso programmi di allevamento consolidati, mentre la marijuana, o cannabis di tipo farmacologico, ha avuto luogo principalmente in programmi clandestini / clandestini attraverso l'attraversamento di landraces e/o lignaggi “indica” e “sativa” 22, 23 . L'obiettivo principale dell'allevamento era aumentare la resa di THC, sebbene siano state prese in considerazione altre caratteristiche tra cui organolettici (aroma), morfologia, densità di colore e tricomi 1, 4, 24. La diversità genetica tra i ceppi di marijuana è inferiore rispetto alle varietà di canapa a causa dell'incrocio di varietà strettamente correlate 2, 3 . Si ritiene che le sintasi di CBDA e THCA siano controllate da due alleli su un singolo locus (B), l'incrocio di ceppi dominanti di CBDA e THCA produrrà una prole con THC totale intermedio: rapporti CBD 5, 25 . Con la prevalenza della propagazione attraverso talee di piante madri, femminilizzazione dei semi e produzione di sensimilla, la necessità di piante maschili è diminuita con conseguente potenziale perdita di diversità genetica e fitochimica 1. I lignaggi "sativa" e "indica" usati per descrivere la cannabis in tutto il settore si basano sulla postulazione secondo cui i ceppi di sativa hanno avuto origine da cultivar europee di canapa, mentre le indica sono da potente, resinosa cannabis indiana 4 ma dato l'uso e il commercio della pianta nell'antica volte, l'origine esatta è sconosciuta e queste potrebbero non essere specie distinte 21. I ceppi moderni sono considerati dominanti in uno di questi due "lignaggi" o ibridi tra parenti stretti. Queste classificazioni si concentrano sugli effetti farmacologici associati ai ceppi in cui le piante sativa sono considerate stimolanti e le piante Indica sono associate al rilassamento e alla sedazione, ma questa non è una classificazione botanica o chemiotassonomica 23. Confronti dei contenuti di cannabinoidi di queste classificazioni hanno dimostrato che il contenuto di THC può essere identico tra questi due gruppi di classificazione 3, 26. Rimangono molte domande: che cos'è una "tensione"? Un "ceppo" rappresenta una varietà fitochimicamente unica? Le "varietà" di coltivatori diversi sono effettivamente diverse? Esiste un modo più appropriato per classificare i "ceppi"? Queste cultivar, varietà, specie terrestri o addirittura specie? Qual è l'impatto dell'addomesticamento sull'idoneità ecologica della specie?

L'allevamento di piante strettamente correlate porta potenzialmente alla perdita della diversità genetica all'interno del genoma27. I tratti che significano la sindrome dell'addomesticamento includono cambiamenti fenotipici come aumento delle dimensioni dei semi, perdita di frantumazione, cambiamenti nella riproduzione, cambiamenti nei metaboliti secondari e perdita di resistenza ai parassiti rispetto agli antenati selvatici27,  28. Le recensioni sull'allevamento di cannabis hanno riassunto l'addomesticamento in termini di morfologia, mentre l'attenzione sul metabolismo secondario si è concentrata principalmente sul contenuto di THC 1, 4. Le recenti valutazioni forensi della cannabis sensibilizzata confiscata negli Stati Uniti hanno mostrato aumenti drammatici del contenuto totale di THC negli ultimi 30 anni, dal 6,3% all'11,5% 29, 30 ma sul mercato sono disponibili varietà con un THC totale superiore al 20%. Questo aumento artificiale della produzione di THCA ha comportato la perdita dell'attività sintasi del CBDA nei ceppi dominanti di THC. Sebbene l'incrocio genererà THC: progenie ibrida di CBD, la perdita di altre vie biosintetiche non è nota a causa dei programmi di allevamento non rigorosi che si concentrano principalmente sulla produzione di un singolo metabolita. I nostri dati indicano che questi programmi genetici hanno anche avuto un impatto su metaboliti correlati sconosciuti con funzione indeterminata.

L'analisi metabolomica può generare classificazioni chemiotassonomiche delle piante oltre all'ipotesi generando una comprensione delle correlazioni dei dati, dell'identificazione dei metaboliti e delle relazioni che non sarebbero possibili attraverso la valutazione del singolo metabolita 15, 31. Utilizzando i dati di correlazione e i grafici dei caricamenti di PCA, possiamo ipotizzare l'identità putativa di alcuni di questi cannabinoidi sconosciuti. Ad esempio, CMPD6 aveva un coefficiente di correlazione di Pearson di 0,89 con CBDA e occupa lo stesso spazio all'interno del diagramma dei carichi PCA. Gli spettri UV con un massimo di 224 nm identificano questo composto come un cannabinoide acido che è stato rilevato solo in presenza di CBDA. Un'ulteriore valutazione ha mostrato che è stato eluito tra CBDVA e CBDA, quindi si ipotizza che sia CBDA-C4 con una catena laterale butilica sul polichetide (Tabella 2) 32. Allo stesso modo, abbiamo identificato putativamente CBDA-C1, CBDM e CBDMA tra le incognite separate dal nostro protocollo di cromatografia (Tabella 2). A causa della presenza della THCA sintasi in tutti i ceppi, i cannabinoidi di correlazione prodotti con questo enzima sono meno evidenti. In precedenza era stato riferito che i cannabinoidi a bassa abbondanza potevano essere regolati dalla biosintesi a monte dei polichetidi precursori 14. Abbiamo trovato meno cannabinoidi sconosciuti nei ceppi selezionati per un più alto contenuto di THC. Con una così forte enfasi sulla sintesi di un singolo metabolita c'è una forte possibilità che altre vie biosintetiche siano state perse nel processo 27, 28.

Diversi sistemi di classificazione sono stati proposti per la cannabis in base a un numero limitato di attributi fenotipici 1, 4, 33. Il concetto di "ceppo" non riflette l'addomesticamento delle colture, i programmi di allevamento o la chimica delle piante. I ceppi disponibili sul mercato canadese sono strettamente correlati e la valutazione delle singole classi di metaboliti non fornisce informazioni sufficienti per comprendere la diversità fitochimica disponibile. L'abbondanza di metaboliti secondari all'interno delle piante non è necessariamente correlata con il significato farmacologico e con la cannabis esiste il postulato "effetto entourage" che descrive gli effetti sinergici di molti metaboliti per l'efficacia medica aneddotica 7. L'addomesticamento delle colture ha limitato la variabilità genetica delle colture e l'impatto sulla diversità delle colture, sulla fisiologia e sul metabolismo non è del tutto chiaro. Sono necessarie ulteriori ricerche per valutare i cannabinoidi a bassa abbondanza per la potenziale efficacia medicinale e per determinare i loro ruoli nel metabolismo delle piante.

Reagenti

Metanolo, acetonitrile, ammonio formiato e acido formico (98%) erano di grado HPLC. L'acqua è stata deionizzata e purificata a 18,2 MΩ usando un sistema nanopure Barnstead Smart2Pure (Thermo Scientific). Gli standard di cannabinoidi per la quantificazione sono stati acquistati da Cerilliant Corp. (Round Rock, TX) per acido tetraidrocannabinolico (THCA), THC, acido cannabidiolico (CBDA), CBD, cannabigerolo (CBG), cannabichromene (CBC), tetraidrocannabivarina (THCV) e cannabinolo (THC) CBN), Δ8-THC, acido cannabidivarinico (CBDVA), cannabidivarin (CBDV), acido cannabigerolico (CBGA) e cannabiciclolo (CBL). Tutti gli standard sono stati forniti come soluzioni da 1,0 mg / mL in metanolo o acetonitrile.

Materiali vegetali

Trentatre ceppi di cannabis sono stati acquistati da cinque produttori autorizzati in Canada ai sensi dei regolamenti sull'accesso alla cannabis per scopi medici e le analisi di laboratorio sono state eseguite in base a una licenza per sostanze e sostanze controllate da Health Canada. I campioni di prova sono stati forniti come fiori interi o macinati in confezioni da 5, 10 e 15 grammi e conservati a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. A causa delle restrizioni legali relative allo stoccaggio di ceppi di cannabis, non è stato possibile inviare campioni di voucher a un erbario, ma dato il quadro normativo associato a queste piante, la loro identificazione è stata confermata come Cannabis sativa L.

Metabolomica mirata dei cannabinoidi

Il contenuto di 13 cannabinoidi è stato determinato secondo un metodo analitico precedentemente validato 20. In breve, i fiori di cannabis macinati (0,200 g) sono stati estratti con 25 ml di metanolo all'80% in una provetta da centrifuga ambra da 50 ml per 15 minuti mediante sonicazione a temperatura ambiente con vortice ogni 5 minuti, seguita da centrifugazione a 4500 g per 5 minuti e filtrazione con filtro PTFE da 0,22 µm. Gli estratti sono stati diluiti entro l'intervallo di calibrazione usando il solvente di estrazione e collocati nel supporto del campione a 4°C per l'analisi in giornata. La separazione cromatografica è stata eseguita su un UHPLC 1200 Agilent con una colonna Kinetex C18 100 mm × 3,0 mm, 1,8 µm (Phenomenex; Torrance, CA) usando un'eluizione a gradiente con ammonio formiato 10 mM (pH 3,6) e acetonitrile. Il campionatore automatico è stato mantenuto a 4°C e il rilevamento era a 220 nm. Le aree di picco per picchi con spettri UV cannabinoidi acidi o neutri tipici che eluiscono tra 2,5 e 14. Sono stati raccolti 5 minuti utilizzando il software Chemstation (Agilent Technologies) e sono stati identificati cannabinoidi noti. I cannabinoidi noti sono stati quantificati in% p/p rispetto alle loro curve di calibrazione individuali utilizzando la calibrazione esterna in Excel™. Il contenuto totale di THC è stato determinato come la somma di THC e THCA oltre ai prodotti di degradazione totale di THC: CBN e Δ8-THC, regolati dai rapporti di massa molare. Il contenuto totale di CBD è stato determinato come la somma di CBDA e CBD regolata dai rapporti di massa molare. regolato dai rapporti di massa molare. Il contenuto totale di CBD è stato determinato come la somma di CBDA e CBD regolata dai rapporti di massa molare. regolato dai rapporti di massa molare. Il contenuto totale di CBD è stato determinato come la somma di CBDA e CBD regolata dai rapporti di massa molare.

Metabolomica non mirata

I cannabinoidi sconosciuti sono stati identificati e numerati in ordine sequenziale come apparivano nel cromatogramma. I cannabinoidi sconosciuti sono stati quantificati come equivalenti di THC usando le curve di calibrazione del THC e ordinati in ordine sequenziale nel cromatogramma come CMPD #.

Analisi dei dati

Per l'analisi multivariata, i valori mancanti sono stati sostituiti con il limite di rilevazione del metodo (MDL) diviso 2 per ciascun cannabinoide assegnato. Nei profili dei cannabinoidi, dove l'MDL non è stato determinato per picchi non assegnati, i dati mancanti sono stati sostituiti con metà dell'MDL di THC. I coefficienti di correlazione di Pearson per determinare le relazioni tra i metaboliti sono stati calcolati usando il cor script in R. Poiché la concentrazione di un dato metabolita non è necessariamente correlata all'attività farmacologica, i dati sono stati scalati automaticamente centrando e ridimensionando in base alla varianza unitaria per dare a ciascun metabolita uguale peso prima delle analisi multivariate. L'analisi dei componenti principali (PCA) e l'analisi della regressione lineare multipla (MLR) sono state successivamente modellate utilizzando Solo + MIA (Eigenvector Research).

Disponibilità dei dati

I set di dati generati durante e/o analizzati durante lo studio attuale sono disponibili dall'autore corrispondente su ragionevole richiesta.

Riferimenti

1. 1.
   Clarke, RC & Merlin, MD Domestica alla cannabis, storia riproduttiva, diversità genetica odierna e prospettive future. Crit. Rev. Plant Sci. 35 , 293–327 (2016).
2. 2.
   Sawler, J. et al . La struttura genetica della marijuana e della canapa. PLoS ONE 10 , e0133292, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0133292 (2015).
3. 3.
   Soler, S. et al . Struttura genetica della Cannabis sativa var. cultivar indica basate sul marcatore SSR genomico (gSSR): implicazioni per l'allevamento e la gestione del germoplasma. Ind. Coltivazioni Prod. 104 , 171–178 (2017).
4. 4.
   Piccolo, E. Evoluzione e classificazione della cannabis sativa (marijuana, canapa) in relazione all'utilizzo umano. Bot. Rev. 81 , 189–294 (2015).
5. 5.
   De Meijer, E. I fenotipi chimici (chemiotipi) della cannabis nel Manuale della cannabis. (ed Pertwee, R.) 89–110 (Oxford Press, 2014).
6. 6.
   Estratti di cannabis e cannabis di McPartland, JM & Russo, EB: maggiore della somma delle loro parti? J. Cannabis Ther. 1 , 103–132 (2001).
7. 7.
   Russo, EB & Taming, potenziale sinergia di cannabis THC ed effetti entourage fitocannabinoidi-terpenoidi. Br. J. Pharmacol. 163 , 1344–1364 (2011).
8. 8.
   ElSohly, MA & Gul, W. Costituenti di Cannabis sativa nel Manuale di Cannabis. (ed Pertwee, R.) 3–22 (Oxford Press, 2014).
9. 9.
   Turner, CA, ElSohly, MA & Boeren, EG Costituenti di Cannabis sativa L. XVII. Una revisione dei costituenti naturali. J. Nat. Prod. 43 , 169–234 (1980).
10. 10.
    Turner, JC, Hemphill, JK & Mahlberg, PG Determinazione quantitativa dei cannabinoidi nei singoli tricomi ghiandolari della Cannabis sativa L. (Cannabacaea). Am. J. Bot. 65 , 1103–1106 (1978).
11. 11.
    Flores-Sanchez, IJ & Verpoorte, R. Metabolismo secondario nella cannabis. Phytochem. Rev. 7 , 615–639 (2008).
12. 12.
    Fellermeier, M., Eisenreich, W., Bacher, A. & Zenk, MH Biosintesi dei cannabinoidi - Esperimenti di incorporazione con glucosio marcato con 13C. Euro. J. Biochem. 268 , 1596–1604 (2001).
13. 13.
    Degenhardt, F., Stehle, F. & Kayser, O. Capitolo 2: La biosintesi dei cannabinoidi nel Manuale di cannabis e patologie correlate. (ed Preedy, VR) 12–23 (Elsevier, 2017).
14. 14.
    Shoyama, Y., Hirano, H. & Nishioka, I. Biosintesi dell'acido propil cannabinoide e sua relazione biosintetica con acidi pentilici e metil cannabinoidi. Phytochemistry 23 , 1909-1912 (1984).
15. 15.
    Turi, CE, Finley, J., Shipley, PR, Murch, SJ & Brown, PN Metabolomica per scoperta fitochimica: sviluppo di approcci statistici usando un sistema modello di mirtilli rossi. J. Nat. Prod. 78 , 953-966 (2015).
16. 16.
    Worley, B. & Powers, R. Analisi multivariate in metabolomica. Curr. Metabolomics 1 , 92–107 (2013).
17. 17.
    Hagel, JM & Facchini, PJ Metabolomica delle piante: piattaforme analitiche e integrazione con la genomica funzionale. Phytochem Rev. 7 , 479–497 (2008).
18. 18.
    Brown, PN, Murch, SJ & Shipley, P. Diversità fitochimica di cultivar di mirtillo rosso (Vaccinium macrocarpon Aiton) mediante determinazione degli antociani e profilazione metabolomica con analisi chemiometriche. J. Agric. Food Chem. 60 , 261–271 (2012).
19. 19.
    Scherling, C., Roscher, C., Giavalisco, P., Schulze, ED & Weckwerth, W. La metabolomica svela gli effetti contrastanti della biodiversità sulle prestazioni delle singole specie vegetali. PLOS One 5 , e12569, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012569 (2010).
20. 20.
    Mudge, EM, Murch, SJ & Brown, PN Analisi più snella e più verde dei cannabinoidi. Anale. Bioanal. Chem. 409 , 3153–3163 (2017).
21. 21.
    Grof, CPL Cannabis, dalla pianta alla pillola. Br. J. Clin. Pharmacol . https://doi.org/10.1111/bcp.13618 (2018).
22. 22.
    Andre, CM, Hausman, JF & Guerriero, G. Cannabis sativa : la pianta delle mille e una molecola. Davanti. Plant Sci. 7 , 19, https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00019 (2016).
23. 23.
    Piomelli, D. & Russo, EB Il dibattito sulla Cannabis sativa contro la Cannabis indica : un'intervista con Ethan Russo, MD. Cannabis Cannabinoid Res. 1 , 44–46 (2016).
24. 24.
    Sexton, M., Shelton, K., Haley, P. & West, M. Valutazione del contenuto di cannabinoidi e terpenoidi: fiore di cannabis rispetto al concentrato supercritico di CO 2 . Planta Med. 84 , 234-241 (2018).
25. 25.
    de Meijer, EPM et al . L'eredità del fenotipo chimico nella Cannabis sativa L. Genetica. 163 , 335–346 (2003).
26. 26.
    Hazekamp, ​​A. & Fischedick, JT Cannabis - dalla cultivar al chemovar. Test anti droga. Anale. 4 , 660–667 (2012).
27. • 27. Meyer, RS, DuVal, AE & Jensen, Modelli e processi delle risorse umane nell'addomesticamento delle colture: una revisione storica e un'analisi quantitativa di 203 colture alimentari globali. Nuovo Phytol. 196 , 299–48 (2012).
    • 
      
28. 28.
    McKey, D., Elias, M., Pujol, B. & Duputie, A. L'ecologia evolutiva delle piante domestiche propagate clonalmente. Nuovo Phytol. 186 , 318–332 (2010).
29. 29.
    ElSohly, MA et al . Tendenze di potenza di Δ9-THC e altri cannabinoidi nella marijuana confiscata dal 1980-1997. J. Forensic Sci. 45 , 24–30 (2000).
30. 30.
    Mehmedic, Z. et al . Tendenze di potenza di Δ9-THC e altri cannabinoidi nella marijuana confiscata dal 1993 al 2008. J. Forensic Sci. 55 , 1209–1217 (2010).
31. 31.
    Fiehn, O. Metabolomics: il legame tra genotipi e fenotipi. Plant Mol. Biol. 48 , 155–171 (2002).
32. 32.
    Smith, RM Identificazione dei cannabinoidi butilici nella marijuana. J. Forensic Sci. 42 , 610–618 (1997).
33. 33.
    Fenotipi di cannabinoidi piccoli, E. & Beckstead, HD in Cannabis sativa . Nature 245 , 147–148 (1973).

Fonte:  Nature